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该研究由Mingsong Xiao、Qinsen Hu、Yan Zhao和Fangyin Bao共同完成，他们均来自安徽科技大学生命与健康科学学院。研究论文于2020年发表在《Conservation Genetics Resources》期刊上，标题为《Development of SNP markers in Leiocassis longirostris Günther using high-throughput sequencing》。
Leiocassis longirostris（长吻鮠）是一种半洄游性淡水鱼类，主要分布于长江干流，但由于过度捕捞、环境污染等人为干扰，其种群数量急剧下降，在许多河流系统中几乎消失。了解其种群遗传结构对于有效保护和管理该物种至关重要。单核苷酸多态性（SNP，Single Nucleotide Polymorphism）因其丰富的遗传变异和广泛的基因组分布，逐渐成为遗传研究的重要DNA标记。然而，关于长吻鮠的SNP研究非常有限。因此，本研究旨在通过高通量测序技术开发长吻鮠的SNP标记，以丰富其分子标记库，为种群遗传学和资源保护提供有价值的信息。
转录组测序与组装
研究首先从长吻鮠的转录组中提取unigene序列，用于开发SNP标记。RNA纯化、反转录、文库构建和测序均在上海迈博生物技术有限公司完成，使用Illumina平台进行高通量测序。测序后，共获得44,153条unigene，平均长度为1,394 bp。
SNP挖掘与筛选
使用Samtools和VarScan v.2.2.7软件对测序数据进行SNP挖掘，共检测到59,650个潜在的SNP位点。最常见的碱基替换类型为C/T和A/G，转换与颠换的比例约为2.58。为了验证SNP位点的多态性，研究随机选择了100个潜在SNP位点，并在30个来自长江南京段的长吻鮠野生个体中进行评估。
基因组DNA提取与PCR扩增
从长吻鮠的背部肌肉中提取基因组DNA，采用标准的酚-氯仿法。使用Primer 5.0软件设计引物，PCR扩增在25 µL的反应体系中进行，包含1.25单位的Taq DNA聚合酶、2.5 µL PCR缓冲液、0.2 mM dNTP混合物、1 mM引物和约100 ng模板DNA。PCR程序包括：95°C初始变性5分钟，随后进行30个循环（94°C变性45秒，58–61.5°C退火45秒，72°C延伸40秒），最后72°C延伸8分钟。
SNP标记的验证与特征分析
使用PopGene 3.1软件计算观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、次要等位基因频率（MAF）和连锁不平衡（LD）。最终，共鉴定出40个多态性SNP标记。Ho的范围为0.0003至1.0000，He的范围为0.3367至0.9390，MAF的范围为0.0167至0.2500。经过Bonferroni校正后，34个SNP位点符合Hardy-Weinberg平衡（p < 0.0013），6个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。
SNP标记的开发与验证
研究成功开发了40个SNP标记，这些标记在长吻鮠的种群遗传研究中具有潜在的应用价值。SNP标记的多态性分析显示，其Ho和He值范围较广，表明这些标记能够有效反映长吻鮠种群的遗传多样性。
Hardy-Weinberg平衡分析
34个SNP位点符合Hardy-Weinberg平衡，表明这些位点在长吻鮠种群中处于遗传平衡状态。6个显著偏离Hardy-Weinberg平衡的位点可能受到选择压力或其他因素的影响。
连锁不平衡分析
未观察到显著的连锁不平衡现象，表明这些SNP标记在遗传分析中可以独立使用，不会因连锁关系而影响结果的准确性。
本研究首次开发了长吻鮠的SNP标记，为研究其种群遗传结构和资源保护提供了重要的分子工具。这些SNP标记具有广泛的应用前景，可用于评估长吻鮠种群的遗传多样性、基因流动和种群分化，为制定有效的保护策略提供科学依据。
首次开发长吻鮠的SNP标记
本研究填补了长吻鮠SNP标记研究的空白，为该物种的遗传学研究提供了新的工具。
高通量测序技术的应用
通过高通量测序技术，研究成功挖掘了大量潜在的SNP位点，并验证了其多态性，展示了高通量测序在遗传标记开发中的优势。
严格的遗传分析
研究对SNP标记进行了全面的遗传分析，包括Hardy-Weinberg平衡和连锁不平衡分析，确保了标记的可靠性和适用性。
本研究得到了安徽省自然科学基金（1708085MC78）和安徽省重点研发计划项目（1804a07020119）的支持。此外，研究遵循了实验室动物使用和护理的指导原则，并符合安徽科技大学关于动物福利的规定，所有手术均在MS-222麻醉下进行。
通过这项研究，我们不仅为长吻鮠的遗传保护提供了新的工具，也为其他濒危淡水鱼类的遗传研究提供了参考。