基于双探针的一锅法RPA-CRISPR/Cas12a技术：一种高灵敏度快速检测豇豆疫霉菌的方法

作者及机构
本研究由Mingze Lin（海南大学三亚南繁研究院与热带农林学院）、Zhiming Zhou、Zhiting Li、Wanzhen Feng、Chengdong Yang、Zaobing Zhu*（江苏省农业科学院植物保护研究所）及Qinghe Chen*（海南大学）共同完成，成果发表于2025年的《Pest Management Science》期刊（DOI: 10.1002/ps.8932）。

学术背景
豇豆疫霉（*Phytophthora vignae*）是豇豆生产中的主要病原体，可导致茎腐病，发病率高达75%，造成严重减产。传统检测方法（如形态学鉴定、PCR和qPCR）存在耗时长、依赖实验室设备、易污染等问题。CRISPR-Cas系统因其高特异性和灵敏度成为新兴分子检测工具，但现有技术需多步骤操作，增加污染风险。本研究旨在开发一种集重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）与CRISPR/Cas12a于一体的“一锅法”检测平台，实现豇豆疫霉的快速、高灵敏现场检测。

研究流程
1. 材料与试剂准备
- 样本来源：从田间感染豇豆植株及海南大学保藏的病原体中分离15种卵菌和4种真菌（表S1）。
- DNA提取：采用CTAB法提取菌丝体DNA，稀释至200 ng/μL备用。
- 引物与crRNA设计：通过BLAST比对筛选豇豆疫霉特异性基因序列（GenBank: ABJUN010000202.1），设计RPA引物（Pv-RPA-F/R）、PCR引物（Pv-F/R）及crRNA（含PAM序列下游20个碱基）。

1. 一锅法RPA-CRISPR/Cas12a体系优化

   • 浓度优化：测试Cas12a/crRNA浓度（50–800 nM）及比例（1:10至2:1），确定最佳条件为Cas12a 600 nM、crRNA 300 nM（比例2:1）。
     
   • 温度与时间：优化反应温度（37–42°C）和时间（5–30分钟），确定两步法（RPA 10分钟+CRISPR 5–10分钟，39°C）和一步法（直接混合，40°C，15分钟）。
     
   • 双探针设计：引入两种FAM-BHQ1荧光探针（FQ-reporter 1: FAM-CCACCC-BHQ1；FQ-reporter 2: FAM-CCCCCC-BHQ1），提升信号强度。
     

2. 特异性与灵敏度验证

   • 特异性：测试19种病原体（含近缘种），仅豇豆疫霉产生荧光信号（图3），无交叉反应。
     
   • 灵敏度：十倍稀释DNA模板（200 ng/μL至20 fg/μL），双探针体系检测限达200 fg/μL（约18.5拷贝/反应），较单探针灵敏度提高20倍（图4–5）。
     

3. 横向流动试纸条（LFS）整合

   • 将CRISPR/Cas12a切割的FAM-生物素报告基因与试纸条结合，阳性样本显示双红线（图6），检测限2 pg/μL，适用于田间可视化判读。
     

4. 田间样本验证

   • 采集海南8份疑似感染样本，一锅法检测结果与qPCR一致，6份阳性（图7），健康样本无假阳性。
     

主要结果
1. 方法创新性
- 首次将双探针引入一锅法RPA-CRISPR/Cas12a体系，反应时间缩短至15–20分钟，灵敏度达200 fg/μL（表2）。
- 两步法（预扩增后离心混合）稳定性高，一步法（直接混合）操作更简便。

1. 性能对比

   • 灵敏度：双探针一锅法 > 单探针一锅法（2 pg/μL） > qPCR（200 pg/μL） > 常规PCR（200 ng/μL）。
     
   • 特异性：仅靶标病原体触发信号，无近缘种干扰（图3）。
     

2. 应用验证

   • LFS与荧光检测结果一致，无需专业设备，适合资源有限地区（图6–7）。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 提出“双探针协同增效”机制，通过多探针并行切割加速荧光信号释放，为CRISPR检测灵敏度提升提供新策略。
- 揭示一锅法中RPA与Cas12a的协同作用：RPA产物积累激活Cas12a反式切割，避免非特异性扩增。

1. 应用价值
   
   • 实现豇豆疫霉的田间快速诊断（<30分钟），助力早期病害防控。
     
   • 平台可扩展至其他植物病原体检测，如大豆疫霉（*Phytophthora sojae*）等。
     

研究亮点
1. 方法学突破
- 首创双探针一锅法体系，灵敏度较传统CRISPR检测提升20倍。
- 整合LFS与荧光双读出模式，兼顾实验室与现场需求。

1. 技术优势

   • 全流程封闭操作，降低气溶胶污染风险。
     
   • 40°C等温反应，摆脱PCR仪依赖。
     

2. 潜在影响

   • 为CRISPR诊断技术在农业病害监测中的标准化应用提供范例。
     
   • 配套干粉试剂开发后可进一步简化运输与储存。
     

其他亮点
- 通过智能手机拍照分析LFS结果（文献49），未来可结合AI实现自动判读。
- 研究获中国国家重点研发计划（2024YFD1400100）及海南省科技项目资助，体现产学研结合特色。

（全文约2000字）