主要作者及发表信息
本研究由Christos Skrekas、Angelo Limeta、Verena Siewers和Florian David等人完成，主要通讯作者为Florian David，其所属单位为瑞典查尔姆斯理工大学（Chalmers University of Technology）生命科学系。该研究成果于2023年7月24日在线发表于学术期刊《ACS Synthetic Biology》。
学术背景与研究目的
定向进化（Directed Evolution）是改善代谢通路中关键酶等蛋白质功能的核心策略。然而，传统的定向进化方法，如易错PCR（Error-prone PCR），其产生的突变文库容量受到细胞转化效率的限制，并且无法在细胞生长过程中实现连续进化。在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中，体内诱变（in vivo mutagenesis）策略虽可实现连续进化，但早期依赖于诱变酶随机突变的方法，容易在目标基因以外的区域产生有害的“旁观者”突变。为解决这些问题，将DNA修饰酶靶向定位到特定基因位点的靶向体内诱变系统应运而生。CRISPR/Cas9技术为此提供了强大的平台，通过将失去切割活性的dCas9蛋白与胞苷脱氨酶（Cytidine Deaminase）或腺苷脱氨酶（Adenine Deaminase）融合，可以在向导RNA（gRNA）的引导下，在特定位点实现精确的碱基编辑。
本研究旨在开发一套高效、时间可控的CRISPR/Cas9靶向诱变工具包，专门用于酿酒酵母。研究团队聚焦于将dCas9蛋白与高活性变体——胞苷脱氨酶AID*Δ和腺苷脱氨酶TadA8e及其低脱靶活性变体TadA8e V106W进行融合，旨在创建可诱导的CRISPR诱变工具，以期在体内对特定DNA序列实现具有拓宽编辑窗口（Editing Window）和高诱变效率的靶向突变。此外，研究还系统探究了gRNA多重化（Multiplexing）对诱变效率的影响。
详细研究流程
该研究主要分为两大模块，分别测试基于胞苷脱氨酶和腺苷脱氨酶的碱基编辑器（Base Editor）性能。
质粒构建与菌株准备： 研究以酿酒酵母CEN.PK113-11C菌株为底盘。所有质粒均采用酵母模块化克隆系统（MoClo）构建。核心构建体包括：将dCas9编码序列通过一个编码100个氨基酸的柔性连接肽（Linker）的序列，分别与密码子优化的高活性胞苷脱氨酶AID*Δ、腺苷脱氨酶TadA8e及TadA8e V106W编码序列融合。这些嵌合蛋白的表达均由半乳糖诱导型*GAL1*启动子（Galactose-inducible GAL1 promoter）严格控制，以实现诱变步骤与筛选步骤的时间解耦。研究选用了*CAN1*基因作为表型报告系统，该基因编码精氨酸渗透酶，其功能失活可使酵母获得刀豆氨酸抗性（Canavanine Resistance, CanR）。针对*CAN1*基因的不同区域，设计了3条gRNA：gRNA1（靶向基因前端，88-108 bp）、gRNA2（靶向基因中部，787-767 bp）和gRNA3（靶向基因中部，826-806 bp）。gRNA以单重、双重（gRNA1+2）和三重（gRNA1+2+3）方式，利用Csy4核糖核酸内切酶系统进行多重表达。
诱变效率的表型与基因型评估： 含有碱基编辑器质粒和gRNA质粒的酵母菌株，首先在棉子糖（Raffinose）培养基中预培养，然后转移至半乳糖培养基中诱导碱基编辑器表达24小时，以启动诱变。表型评估通过刀豆氨酸抗性实验进行。将诱导后的菌液进行梯度稀释，分别涂布于不含和含有刀豆氨酸的合成缺陷型平板。培养后计算CanR菌落形成单位（CFU）与总CFU的比值，作为CanR形成频率，以此衡量诱变效率。基因型评估则采用了两种测序策略。首先，对未经过刀豆氨酸筛选的细胞群体进行新一代测序（NGS），以避免表型筛选带来的偏差。研究者扩增了*CAN1*基因上的三个约200 bp的片段进行分析：片段A（涵盖gRNA1结合区）、片段B（涵盖gRNA2和gRNA3结合区）和片段C（无gRNA结合的远端区域，用于评估脱靶效应）。NGS数据经ngmerge、Burrows-Wheeler Aligner、samtools和bcftools等工具处理，并使用R语言进行深度归一化、突变比例计算和碱基替换频谱分析。其次，对所有CanR克隆进行Sanger测序，对从表型筛选获得的阳性克隆进行目标区域的扩增和测序，以鉴定导致功能丧失的关键突变。
主要研究结果
1. dCas9-AID*Δ系统的性能： * 表型结果：单独表达任何一条靶向gRNA，CanR形成频率约为10⁻⁴，相比背景水平（约10⁻⁶）提高了约100倍。当gRNA1和gRNA2双重表达时，频率提升至10⁻³；当三条gRNA三重表达时，频率进一步提升至10⁻²。这表明gRNA多重化能显著、协同地增强诱变效率。 * NGS基因型结果：在单个gRNA表达时，突变效率较低。双重gRNA表达时，在两个gRNA的PAM序列 ±20 bp区域内，突变效率均被放大。三重gRNA表达时，尤其是在距离仅39 bp的gRNA2和gRNA3的PAM位点之间，突变频率急剧增加，表明邻近结合的dCas9-AID*Δ存在强烈的协同效应。突变频谱分析显示，所有类型的碱基替换均有所增加，但C>G/T和G>A/C的突变率增幅最为显著，尤其在多重gRNA条件下。由于gRNA2和gRNA3均结合非编码链，导致编码链上观察到大量的G突变。通过对单个测序读段（Read）进行逐条分析，发现三重gRNA表达显著增加了片段A和B中的独特读段数量，尤其在片段B中更甚，进一步证实了邻近靶向对编辑效率的增强作用。 * CanR克隆Sanger测序结果：对20个CanR克隆测序发现，单个gRNA1表达时，约40%的克隆在其结合位点携带突变。但令人意外的是，多重gRNA表达时，观察到的突变频率并没有像NGS数据那样呈现出剧烈的提升，这可能是因为表型筛选过滤掉了大量不导致刀豆氨酸抗性的突变，反映了筛选偏差。
2. dCas9-TadA8e及TadA8e V106W系统的性能： * 表型结果：两种腺苷脱氨酶编辑器在单个gRNA表达时的CanR形成频率与AID*Δ系统相似。然而，当三条gRNA三重表达时，CanR形成频率相比最有效的单个gRNA提升了10倍，再次验证了gRNA多重化增强诱变效率是一个通用原理。TadA8e V106W变体在维持高靶向活性的同时，其脱靶活性（通过ADE2基因的gRNA评估）显著低于TadA8e。 * CanR克隆Sanger测序结果：对15个CanR克隆进行测序分析，突变几乎全部发生在gRNA结合位点内，且突变为单一的T>C（编码链）或A>G（非编码链）替换。TadA8e-dCas9的编辑窗口从PAM上游-7 bp延伸至-18 bp，最远观测到+37 bp处的单突变，窗口较哺乳动物细胞中的报道更宽。当gRNA2和gRNA3多重表达时，gRNA2结合区靠近PAM的位点不再发生突变，但-12/-13和-17/-18位点的突变率得以维持。TadA8e V106W变体的靶向编辑窗口和效率略有降低，尤其在多重gRNA表达时更明显，但其较低的脱靶活性使其成为更精准的诱变工具。
研究结论与价值
本研究成功在酿酒酵母中建立并系统评估了基于CRISPR/dCas9的高效体内靶向诱变系统。核心结论是，通过融合高活性脱氨酶（AID*Δ, TadA8e）并采用Csy4介导的gRNA多重化策略，可以实现对目标基因窗口的高效、协同诱变，显著提高了突变效率和文库多样性。这种协同效应可能归因于AID的二聚化倾向以及Cas9蛋白在邻近PAM位点的侧向扩散（Lateral Diffusion）扫描机制。研究证明，靶向腺苷脱氨酶TadA8e V106W是开发低脱靶风险诱变工具的优秀候选。
该研究的科学价值在于，它不仅提供了性能数据，还深入揭示了gRNA多重化增强诱变的作用机制和设计原则。其应用价值在于，所开发的工具包为酿酒酵母的定向进化提供了强大平台。研究人员可以利用可诱导表达的特性，先进行诱变，再进行筛选，实现了突变积累与表型富集的分离或并行，尤其适用于进化特定蛋白结构域，或通过覆盖目标基因的gRNA文库进行多区域平行进化。该工具在代谢工程、酶工程和合成生物学领域具有广阔的应用前景，能有效推动高性能微生物细胞工厂的开发。
研究亮点 * 技术整合与创新：将高活性脱氨酶变体与dCas9融合，并在酵母中结合Csy4多重gRNA表达系统，构建了一套可诱导、高效率的体内连续进化工具。 * 关键机制发现：系统性地证实并阐释了gRNA多重化，特别是靶向邻近区域的gRNA组合，能够通过潜在的蛋白质二聚化或Cas9扫描机制，产生“1+1>2”的协同诱变效应，大幅拓宽编辑窗口和提升突变频率。 * 系统性比较评估：通过表型筛选（CanR频率）、无偏差NGS深度测序和Sanger测序三个层次的数据，全面对比了胞苷和腺苷脱氨酶在不同gRNA配置下的性能，包括编辑窗口、突变偏好和脱靶效应，为工具选择提供了全面指导。