本研究论文《Metabolomic analysis reveals the diversity of defense metabolites in nine cereal crops》由Huang, S.; Li, X.; An, K.; Xu, C.; Liu, Z.; Wang, G.; Hou, H.; Zhang, R.; Wang, Y.; Yuan, H.; et al.等作者合作完成。第一作者Huang, S.和Li, X.为共同第一作者，通讯作者为Honglun Yuan和Jie Luo。研究团队主要来自海南大学三亚研究院（热带作物育种全国重点实验室、育种与扩繁学院）和武汉轻工大学生命科学与技术学院等机构。该研究于2025年2月19日发表在期刊《Plants》（2025年第14卷，第629期），采用知识共享署名许可协议（CC BY 4.0）。
该研究属于植物代谢组学与作物抗逆性生物学交叉领域。谷物作物作为全球重要的主食来源，其抗逆性直接影响产量和粮食安全。不同谷物作物对环境胁迫（如干旱、高低温、病虫害）的耐受性存在显著差异，而植物次级代谢产物，特别是防御性代谢产物，是介导这些抗逆反应的关键化学物质基础。尽管针对单一物种内特定防御代谢物的研究已有不少，但对于不同谷物作物种类间防御代谢物的系统性比较分析仍显不足。本研究旨在通过代谢组学技术，全面描绘并比较九种主要和次要谷物作物叶片代谢组的异同，重点关注苯并噁嗪类（benzoxazinoids）和黄酮类（flavonoids）等防御性代谢物的多样性与分布规律，从而在代谢水平上揭示不同谷物作物潜在抗逆机制的差异，为理解作物环境适应性差异以及未来抗逆育种改良提供有价值的代谢背景信息和资源。
研究详细流程严谨，涵盖了材料准备、代谢物提取、数据采集与分析等多个关键步骤。
首先，在植物材料准备与培养阶段，研究选取了九种代表性谷物作物：水稻（Oryza sativa L.）、小麦（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、普通燕麦（Avena sativa L.）、谷子（Setaria italica L., 文中称foxtail millet）、黍子（Panicum miliaceum L., 文中称broomcorn millet）和薏苡（Coix lacryma-jobi L., 文中称adlay）。此外，还以大豆作为外群对照。所有材料在人工气候室中严格控温、控光（14小时光照/10小时黑暗，湿度65%）条件下培养。水稻采用水培，其他作物采用营养土栽培。当作物长至五叶期时，采集成熟叶片作为样本。每个物种设置三个生物学重复，每个重复的样本来自至少三株植物的混合叶片。样品采集后立即用液氮速冻，并于-80°C保存备用。
其次，进行样品制备与代谢物提取。将冻干后的样品研磨成粉，称取100毫克，加入含有内标（利多卡因）的预冷70%甲醇水溶液进行提取。样品经涡旋、静置、过夜浸提后，离心取上清，过0.22微米滤膜，制备成待测液。同时，将每个样品取等量混合制备成质量控制样品，用于评估仪器稳定性。
第三，是代谢组学数据采集，本研究结合了非靶向和广靶向代谢组学两种策略。非靶向代谢组学分析使用LC-ESI-Q-TOF-MS/MS系统，在正、负离子模式下对每个物种的混合样本进行全扫描和依赖信息的二级质谱采集，旨在无偏倚地获取尽可能多的代谢物特征信号。数据分析使用MS-DIAL软件进行峰提取和对齐，共获得9869个特征信号。基于这些信号进行的主成分分析初步显示了不同作物代谢组的差异，特别是薏苡和大麦与其他作物分离明显。然而，非靶向方法的定量准确性有限。为了获得更精确的定量结果，研究人员基于非靶向数据构建了一个MS²谱标签库，并据此开发了广靶向代谢组学方法。广靶向分析使用LC-ESI-QTrap-MS/MS系统在多反应监测模式下进行，对目标代谢物进行精确定量。
第四，进行代谢物鉴定。研究人员根据质谱碎片模式、保留时间并与标准品比对，对检测到的代谢物进行定性鉴定。论文以HMBOA-乙酰基-葡萄糖苷和C-葡萄糖基木犀草素-O-戊糖为例，详细展示了如何通过分析前体离子、特征碎片离子（如y0⁺, z0⁺离子）以及中性丢失（如丢失乙酰己糖204 Da、戊糖132 Da等），结合已知的苯并噁嗪类和黄酮类化合物的裂解规律，对未知代谢物进行结构推导。最终，共成功注释了1131种代谢物，并归入18个大类，其中数量较多的包括黄酮类（311种）、脂类（172种）、氨基酸及其衍生物（101种）、生物碱（64种）、羟基肉桂酰衍生物（59种）等。
第五，进行代谢组数据的差异分析。这包括代谢物组成差异和丰度差异两个方面。在组成上，研究人员统计了各作物中检测到的代谢物数量，并分析了物种间共有及特有的代谢物。结果显示，有531种代谢物在所有九种作物中都被检测到，占注释代谢物总数的46.9%。同时，每个物种都拥有4到12种特有的代谢物，例如高粱有12种特有代谢物，而玉米和普通燕麦各有4种。重点关注防御代谢物类别发现，8种苯并噁嗪类化合物为玉米、小麦和薏苡所特有。通过计算各类代谢物在各物种中检出比例的变化系数，发现苯并噁嗪类的变化系数最高（151%），其次为酚胺类（30%），黄酮类为11%，这表明苯并噁嗪类在谷物中的分布最为特化。在丰度差异上，研究人员对1131种代谢物在九个物种中的丰度进行了层次聚类分析，将所有代谢物划分为九个簇，每个簇的代谢物在其对应的作物中表现出相对较高的丰度。例如，第I簇对应于玉米富集的115种代谢物，第II簇对应于薏苡富集的128种代谢物，第V簇对应于小麦富集的154种代谢物等。进一步的京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，与胁迫相关的苯丙烷类生物合成和黄酮类生物合成通路在多个簇中被富集，苯并噁嗪类生物合成通路在薏苡对应的第II簇中也有富集趋势。
第六，专门针对防御代谢物进行深入分析。研究人员将检测到的代谢物映射到已知或推测的生物合成通路上进行可视化分析。对于苯并噁嗪类，他们重建了包含8种已检测化合物的通路图，其中HMBOA-乙酰基-葡萄糖苷、HMBOA-葡萄糖苷-鼠李糖等4种化合物的合成步骤尚未有报道，论文据此提出了推测的酶催化反应。丰度分析显示，HBOA-葡萄糖苷、DIBOA-葡萄糖苷、DIMBOA-葡萄糖苷-己糖和DIMBOA-葡萄糖苷这四种HBOA下游化合物在玉米中含量相对更高，而小麦和薏苡则分别在其他特定化合物上积累较高。对于黄酮类，通路图谱分析揭示了不同作物在黄酮代谢上的偏好：薏苡和玉米含有更多的花青素和3-位羟基化的黄酮醇；黄酮C-糖苷在小麦和玉米中积累更多，而在薏苡中积累最少。一个突出的例子是，薏苡显著富集高度羟基化的黄酮——三羟黄酮（tricetin），而其甲基化产物苜蓿素（tricin）在薏苡中含量较低，却在小麦中积累较多。更有趣的是，小麦还特异性大量积累了一种4‘-甲基化的苜蓿素衍生物——三甲氧基苜蓿素（trimethoxytricetin）的糖苷形式。
研究的主要结论是，通过对九种谷物叶片的比较代谢组学分析，系统揭示了其防御代谢物的多样性图谱。研究发现超过一千种注释代谢物，其中约半数在所有作物中共存，同时每个物种都拥有独特的代谢指纹。特别重要的是，研究确认了苯并噁嗪类作为玉米、小麦和薏苡的特有防御代谢物，并揭示了它们在三种作物中合成与积累模式的异同。在黄酮代谢方面，研究发现了显著的种间差异，例如薏苡对三羟黄酮的偏好以及小麦对三甲氧基苜蓿素糖苷的特异性积累。这些代谢物组成和丰度的差异，很可能与不同谷物作物对环境胁迫（如病虫害、干旱、UV-B等）的不同适应策略和耐受能力密切相关。
本研究的科学价值在于，首次在代谢组尺度上对多种谷物作物进行了系统性比较，填补了不同谷物间防御代谢物差异认知的空白。它不仅提供了详实的代谢物清单和丰度数据，更重要的是通过通路映射和聚类分析，将离散的代谢物数据整合到生物学背景中，提出了新的代谢途径假设（如苯并噁嗪类的新修饰步骤），并为理解物种特异的代谢表型（如小麦的三甲氧基苜蓿素积累）提供了线索。其应用价值在于，研究鉴定的特有或富集代谢物，如玉米中高丰度的HBOA下游苯并噁嗪、小麦中的三甲氧基苜蓿素等，可以作为潜在的生物标志物或遗传改良靶点。例如，将苯并噁嗪类合成通路引入缺乏此类物质的水稻等作物，可能有助于提高其抗虫性。该研究为作物抗逆性的代谢工程和分子育种提供了宝贵的“代谢蓝图”和资源库。
本研究的亮点突出。首先，研究对象具有广泛的代表性：涵盖了从主粮（水稻、小麦、玉米）到小杂粮（薏苡、谷子、黍子等）共九种不同进化分支的谷物，使得比较结果更具普遍性和系统性。其次，采用了整合的分析策略：结合非靶向的发现能力和广靶向的定量精度，确保了数据的全面性和可靠性。第三，深入的代谢物注释与通路解析：不仅停留在代谢物清单层面，更通过质谱碎片解析对未知结构进行推测，并将数据映射到生物合成通路中，使结果具有更强的生物学洞察力。第四，发现了关键的种特异性代谢现象：如苯并噁嗪类在三种作物中的特异性分布，以及小麦中三甲氧基苜蓿素的特异性积累，这些发现将代谢差异与可能的酶功能差异联系起来，为后续功能研究指明了方向。
此外，论文在讨论部分还展望了未来研究方向，例如分析不同组织、发育阶段或胁迫条件下的代谢物变化，以更全面地揭示谷物防御代谢物的多样性。同时，也探讨了将防御代谢物用于作物遗传改良的潜力和挑战，强调了在考虑食用安全性的前提下，利用代谢工程增强作物抗逆性的前景。这项研究通过精密的代谢组学比较，为我们理解谷物作物抗逆性的化学基础打开了一扇新的窗口，其产生的数据和结论将为相关领域的研究者和育种家提供重要的参考和启示。