学术研究报告：通过改进的双碱基编辑器人工进化OsEPSPS基因获得水稻草甘膦抗性新等位基因

一、研究团队与发表信息
本研究由Chen Zhang、Xue Zhong、Shaoya Li等共同完成，通讯作者为Lanqin Xia（中国农业科学院作物科学研究所）。研究成果发表于2023年9月的《Journal of Integrative Plant Biology》（JIPB），标题为《Artificial evolution of OsEPSPS through an improved dual cytosine and adenine base editor generated a novel allele conferring rice glyphosate tolerance》，DOI: 10.1111/jipb.13543。

二、学术背景与研究目标
草甘膦（glyphosate）是全球使用最广泛的广谱除草剂，其作用机制是通过竞争性抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，阻断植物莽草酸途径（shikimate pathway），导致芳香族氨基酸合成受阻。然而，现有水稻品种普遍对草甘膦敏感，田间施用易导致减产。传统转基因方法虽可引入外源抗性基因（如EcABCC8），但面临生物安全评估周期长和公众接受度低的限制。因此，本研究旨在通过双碱基编辑器（dual base editor）对水稻内源OsEPSPS基因进行人工进化，创制非转基因的草甘膦抗性水稻种质。

三、研究流程与方法
1. 双碱基编辑器STCBE-2的开发
- 构建策略：将高效胞嘧啶脱氨酶（evoFERNY）和腺嘌呤脱氨酶（TadA8e）融合至nCas9-NG蛋白的N端，C端添加两个尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），形成新型编辑器STCBE-2。
- 优化验证：通过水稻原生质体瞬时表达系统测试6个内源靶标（如OsGRF4、OsEPSPS等），STCBE-2的C-to-T和A-to-G编辑效率分别达25.5%和25.3%，编辑窗口扩展至C1-C14和A1-A10，优于此前报道的STEME-NG系统（效率提升2.9倍和13.2倍）。

1. OsEPSPS基因的饱和诱变

   • 靶点设计：基于OsEPSPS蛋白结构预测，设计35条sgRNA覆盖保守功能域和草甘膦结合域，分为11个sgRNA池。
     
   • 转化与筛选：通过农杆菌介导转化水稻品种“中花11”愈伤组织，在含草甘膦（10 mg/L）和潮霉素（50 mg/L）的培养基中筛选抗性植株。共转化2600个独立愈伤组织，最终获得9株抗性植株。
     

2. 抗性等位基因鉴定

   • 基因型分析：高通量测序发现2株携带相同突变（sgRNA-G19介导的C10-to-T10），导致OsEPSPS第213位天冬氨酸（Asp）突变为天冬酰胺（Asn）（D213N）。该位点位于预测的草甘膦结合域α-螺旋与β-折叠之间，电荷变化可能降低草甘膦结合能力。
     

3. 抗性表型验证

   • 田间试验：T1代纯合植株在4倍推荐剂量草甘膦（5400 g a.i./ha）喷洒后正常生长，而野生型植株死亡。但纯合D213N植株表现生长缺陷和完全不育，杂合植株仅花期延迟。
     

四、主要研究结果
1. STCBE-2的高效性：在16个内源靶标测试中，STCBE-2的编辑效率显著提升，且副产物（如C-to-G、C-to-A）发生率低于1.7%，无Indel产生。
2. D213N等位基因的功能：分子模型显示D213N突变可能通过改变β-折叠构象和氢键网络削弱草甘膦结合。
3. 应用潜力：尽管纯合植株不育，杂合植株的抗性为田间杂草管理提供了新策略。

五、研究结论与价值
本研究开发了高效双碱基编辑器STCBE-2，实现了水稻内源基因的定向进化，创制了首个非转基因草甘膦抗性水稻新种质。其科学价值在于：
1. 方法学创新：STCBE-2的宽编辑窗口和高效率为作物基因人工进化提供了通用工具。
2. 应用潜力：D213N等位基因可直接用于杂交水稻育种，适应轻简化栽培需求。

六、研究亮点
1. 多维度优化：通过融合evoFERNY与TadA8e，解决了传统双碱基编辑器效率低的问题。
2. 全流程验证：从编辑器开发、基因编辑到田间表型分析，形成完整证据链。
3. 非转基因策略：避免了外源基因引入的监管障碍。

七、其他价值
研究还发现纯合D213N植株的生殖缺陷，提示OsEPSPS在莽草酸途径中的关键作用，为后续机制研究提供了方向。专利已申请（OsEPSPS-D213N等位基因），具有商业化前景。