学术研究报告

一、研究基本信息

本研究由华东理工大学化学院与分子工程学院的鲍春燕（Chunyan Bao）教授课题组，以及吉林大学生命科学学院的赵丽（Li Zhao）课题组合作完成。论文第一作者为Yanxin Xiang、Huanv Mao、Si-Cheng Tong等人。该研究成果于2023年3月9日在线发表于国际著名学术期刊《ACS Nano》，论文标题为“A Facile and Versatile Approach to Construct Photoactivated Peptide Hydrogels by Regulating Electrostatic Repulsion”（一种通过调控静电排斥构建光激活多肽水凝胶的简便通用方法）。

二、研究背景与目的

超分子水凝胶（Supramolecular Hydrogels）与传统共价交联聚合物水凝胶不同，其网络结构由分子基元通过氢键、π-π堆积、疏水作用以及静电相互作用等非共价力自组装（Self-Assembly）形成。短肽因其氨基酸序列的多样性和可设计性，成为构建刺激响应性水凝胶的首选构建单元。其中，光刺激因其可提供精确的空间（Spatial）和时间（Temporal）分辨率而备受关注，成为精确调控水凝胶性质的有力工具。

然而，现有的光响应多肽水凝胶设计策略面临诸多挑战。例如，光致异构基团的可逆转化虽能实现溶胶-凝胶转变，但其异构体的低稳定性限制了凝胶形状和强度的精确控制。利用光可裂解基团（Photocleavable Group）封闭氨基酸残基来阻止组装、光照后触发水凝胶形成的策略，虽然生物相容性良好，但多肽序列设计复杂，要求极高的经验。另一种将高亲水基团通过光裂解基团连接到肽水凝胶剂（Peptide Gelator）上的通用策略，则因响应延迟（数小时）而缺乏时空控制能力。鉴于电荷吸引与排斥是调控多肽水凝胶形成与溶解的另一重要驱动力，本研究提出了一种简单、通用的新型策略：通过引入可光移除的电荷排斥片段，来实现光激活多肽水凝胶的快速构建。

三、研究流程与方法

研究第一环节是多肽水凝胶剂的设计与制备。研究团队首先设计了一种具有高聚集倾向（High Aggregation Propensity）的多肽水凝胶剂，其核心序列为疏水性的三苯丙氨酸残基（Tripeptide FFF）。为了在水中促进其自组装成纤维状水凝胶，研究人员在其N端引入了两个亲水的天冬氨酸残基（Aspartic acid, D），形成了 DD-FFF 多肽。在酸性条件下，该序列的天冬氨酸残基质子化，静电排斥力减弱，可通过分子动力学模拟（Molecular Dynamics, MD）观察到其迅速自组装成交联的纤维网络结构，并通过流变学分析（Rheological Analysis）验证了其溶胶-凝胶转变能力。

第二环节是光响应多肽的全套构建。基于上述水凝胶剂，作者遵循三大模块化原则设计了一个完整的光响应多肽：（1）一个具高自组装倾向的肽水凝胶剂载体（DD-FFF）；（2）一个可提供强静电排斥力以阻止预组装的带正电荷序列，即两个赖氨酸残基（Lysine, K），在酸性溶液中形成正电荷排斥以确保前体肽的溶解性；（3）一个光可裂解的2-硝基苄酯基团（2-Nitrobenzyl Ester Group, NB）连接子。通过固相合成法（Solid-Phase Synthesis），将这三部分合成为完整肽 DD-FFF-NB-KK（简称 DNBK）。高效液相色谱（HPLC）分析证实，在395纳米光照下，NB连接子发生有效裂解，保护基团KK离去，并高产率地释放出具有自组装能力的DD-FFF片段，这是实现光控凝胶化的化学基础。

第三环节是光控自组装行为的系统性表征与时空可控性验证。研究人员利用圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）分析发现，DNBK 溶液在光照前表现为无规卷曲（Random Coil）结构，光照后则转变为与纯DD-FFF凝胶一致的β-折叠（β-sheet）信号。硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光探针结合实验进一步印证了光照可诱导β-折叠淀粉样纤维的生成。通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）能直观地观察到，随着光照时间从0分钟延长至20分钟，多肽从无到有，从短纤维和纳米球演变为长而稀疏的纳米纤维，最终交织成致密的网络结构。至关重要的是，流变学分析展示了其精确的光剂量依赖性：在“开灯-关灯”交替控制下，水凝胶的储能模量（Storage Modulus, G’）呈现阶梯式增长，表明凝胶化过程在光照停止时显著减缓并趋于停滞，复照后又继续进行，实现了对凝胶力学性能的时间程控。在空间控制方面，研究利用光掩模（Photomask）技术，成功制备了星形、方格、网格和线条等多种图案化的水凝胶，并通过ThT染色及共聚焦显微镜成像验证了其高保真度，SEM也证实图案化区域均由纠缠的纳米纤维组成。

第四环节是中性条件下的多肽优化与细胞培养应用。由于DNBK需要在酸性条件下工作，限制了其生物应用，团队对分子结构进行了优化。他们将N端的天冬氨酸-天冬氨酸（DD）序列替换为电中性的Fmoc-KD，得到新的多肽Fmoc-KD-FFF-NB-KK（简称Fmoc-KDNBK）。这一改进成功使光激活自组装和水凝胶形成能够在生理中性pH（7.2）条件下实现。在进行细胞实验前，CCK-8细胞毒性测试显示，Fmoc-KDNBK溶液及其光激活形成的水凝胶对人血管内皮细胞（HUVEC）均表现出良好的细胞相容性。在二维（2D）细胞培养中，HUVEC能在光照制备的水凝胶表面很好地黏附和增殖。光控溶胶-凝胶转变特性为三维（3D）细胞封装提供了独特优势：将细胞与肽溶液混合后，通过控制光照区域，能够原位地将细胞封装进图案化的水凝胶中。活/死细胞染色（Live/Dead Assay）实验显示，封装2小时后的HUVEC细胞存活率很高，培养16小时后，细胞在水凝胶中展现出了铺展（Spreading）的形态，这是细胞-基质（Cell-Matrix）相互作用的良好标志。为进一步探究光控力学性能的应用价值，研究选用对基质刚度敏感的骨髓间充质干细胞（hMSCs）作为模型。通过简单改变光照时间（10分钟 vs. 40分钟），制备出储能模量分别为10 Pa和10000 Pa的弱与强两种水凝胶。结果显示，hMSCs在强水凝胶上展现出更大的铺展面积和更高的长宽比（Aspect Ratio），成功实现了通过光来调控干细胞行为。

四、主要结果与贡献

本研究通过精确的模块化分子设计，成功创建了一种新型的光响应短肽体系，该体系利用可光移除的静电排斥力作为控制开关。实验结果完整地验证了整个研究设想：如方案所预期，连接有正电排斥基团的前体肽能稳定溶解于水溶液中，而通过光照移除该基团后，暴露出的高聚集倾向的肽片段能迅速进行自组装，从而形成纳米纤维网络和水凝胶。该策略的核心优势在于其快速响应性，溶胶-凝胶转变可在数分钟内完成，从而真正实现了时间与空间上的精确控制。光剂量可阶梯式调控水凝胶的最终力学强度，而光掩模技术则能构建出具有复杂形状的图案化水凝胶。此外，该策略展现出良好的通用性和可优化性，通过更换为适合中性环境的凝胶因子，成功地将该平台应用于活细胞的二维、三维培养以及干细胞行为的机械调控，证明了其在模拟细胞外基质（ECM）方面的巨大潜力。

五、研究结论与展望

本研究提出并验证了一种构建光激活多肽水凝胶的简便且通用的新策略。该策略通过光化学移除引起电荷排斥的多肽片段，瞬时而局域地激活高聚集倾向肽的自组装，实现了对水凝胶形成的快速时空控制。此项工作不仅为智能响应性肽基水凝胶的理性设计提供了一个全新的分子范式（Molecular Paradigm），拓宽了超分子自组装领域的工具箱，而且还展示了该平台在生物医学领域，特别是在细胞三维培养、组织工程和细胞力学行为调控等方面的广阔应用前景。

六、研究亮点

本研究的主要亮点可归纳为三点：第一，设计策略的通用性和简便性。它将复杂的肽设计拆解为“高聚集倾向凝胶因子”、“光裂解连接子”和“带电阻断基团”三个简单模块，通过组合即可预测性地构建光响应水凝胶，极大降低了设计门槛；第二，优异的时空控制精度。与之前报道的数小时延迟响应不同，该系统实现了快速的光控溶胶-凝胶转变，使水凝胶的力学强度可按需通过光照时间进行精准梯度调节，并能通过光掩模铸造微米级精度的任意图案化结构；第三，生物应用潜力的有力证明，优化后的肽实现了生理条件下的光交联，并成功用于2D和3D细胞培养，尤其是通过非侵入式的光控制手段精准调控水凝胶强度，进而调节干细胞的铺展行为，为构建仿生细胞微环境提供了强有力的新材料。