基于单细胞测序技术解析墨西哥钝口螈（Axolotl）肢体再生过程中的免疫与非免疫细胞图谱

一、 研究作者、机构及发表信息

本研究由美国肯塔基大学（University of Kentucky）的A. Katherine Rodgers、Jeramiah J. Smith和S. Randal Voss共同完成。其中，Rodgers来自神经科学系、脊髓与脑损伤研究中心以及Ambystoma遗传资源中心，Smith来自生物系。研究论文于2020年9月15日正式发表在《实验细胞研究》（*Experimental Cell Research*）期刊上，卷号为394，文章编号为112149。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于发育生物学、再生生物学和免疫学的交叉领域，聚焦于墨西哥钝口螈（*Ambystoma mexicanum*）这一具有强大再生能力的模式生物。已知免疫细胞对于墨西哥钝口螈成功的肢体再生至关重要，例如巨噬细胞的耗竭会导致再生失败。然而，关于参与再生的免疫细胞的具体身份、行为动态和功能细节，此前仍有许多未解之谜。尽管已有研究利用单细胞转录组测序（single-cell transcript sequencing）在再生肢体中发现了具有免疫细胞特征的群体，但尚未有研究专门富集并系统性地鉴定墨西哥钝口螈外周免疫细胞的类型，并追踪它们在再生早期的动态变化。

因此，本研究旨在填补这一空白。其核心目标是：1）利用单细胞测序技术，从墨西哥钝口螈血液和腹腔（一个已知的巨噬细胞储库）中分离免疫细胞，建立其基因表达谱，从而鉴定出不同的免疫细胞类型及其特异性标志基因。2）将上述获得的标志基因作为参照，分析在肢体截肢后第1天（1 dpa）和第6天（6 dpa）这两个早期时间点，再生残端组织中存在的免疫与非免疫细胞群体，并量化其丰度变化。最终，通过解析再生早期阶段的细胞组成动态，为理解免疫细胞在组织再生中的作用机制提供更精细的图谱和基因资源。

三、 详细研究流程

本研究包含两个主要部分：外周免疫细胞的鉴定和再生肢体细胞的动态分析。整体工作流程严谨，结合了细胞生物学、分子生物学和生物信息学方法。

第一部分：外周免疫细胞的单细胞图谱构建

1. 样本制备与细胞分离：

   • 样本1（外周白细胞）：从一只成年雌性墨西哥钝口螈股静脉采集约300微升血液，通过Percoll密度梯度离心分离出白细胞（含血小板），最终获得7，889个细胞用于测序。
   • 样本2（富集的白细胞与巨噬细胞）：为了更全面地捕获免疫细胞类型，特别是巨噬细胞，研究团队制备了三个富集组分并混合：a) 从两只成年雌性墨西哥钝口螈血液中，通过不连续Percoll梯度离心分别富集中性粒细胞（富集度21%）和单核细胞（富集度16%）；b) 从另一只成年雌性墨西哥钝口螈的腹腔灌洗液中获取细胞，该组分预计富含巨噬细胞（占74%）。将这三个组分等细胞数混合，构成样本2，共包含4，988个细胞。

2. 单细胞测序与数据分析：

   • 使用10x Genomics Chromium单细胞3‘ RNA-seq试剂盒（v2化学）构建单细胞文库，目标每个文库捕获10，000个细胞。
   • 在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，每个文库产生超过10亿条读长。使用Cell Ranger软件进行序列比对、细胞条形码分配和转录本定量。
   • 采用K-means聚类算法对基因表达数据进行聚类分析，以识别不同的细胞群体。使用Loupe Cell Browser软件进行t-SNE可视化。
   • 通过比较各细胞群体中显著上调的基因（Benjamani-Hochberg校正p值 < 0.05），并参考NCBI数据库、已发表文献（特别是Leigh等人2018年的研究）中已知的细胞类型特异性标志基因，对每个细胞群体进行生物学注释。

第二部分：再生肢体早期细胞的动态分析

1. 样本制备：

   • 对两只成年雌性墨西哥钝口螈进行前臂截肢。
   • 分别在截肢后第1天（1 dpa）和第6天（6 dpa），采集每只动物残端远端1毫米的组织样本。每个时间点一个样本。
   • 组织样本经过酶解（Liberase）和机械分离，制备成单细胞悬液。特别注意，1 dpa样本因含有较多细胞外基质碎片，额外使用了40% Percoll溶液离心以去除碎片和死细胞。

2. 单细胞测序：

   • 同样使用10x Genomics平台，对1 dpa（8，272个细胞）和6 dpa（9，906个细胞）的细胞悬液分别进行单细胞转录组测序。

3. 数据分析与细胞鉴定：

   • 对合并的1 dpa和6 dpa数据再次进行K-means聚类，共识别出8个细胞群体。
   • 为了无偏倚地鉴定这些细胞群体的身份，研究人员将每个肢体细胞群体中表达最显著的30个基因，与外周免疫细胞鉴定中获得的各免疫细胞群体（血小板、B细胞、T细胞、红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、髓系样细胞）的最显著30个基因进行比对。
   • 根据基因重叠情况，初步判断肢体细胞群体中哪些对应于已知的免疫细胞类型。对于没有显著基因重叠的群体，则通过检查其高表达基因的功能，结合Gene Ontology（GO）富集分析（使用ToppGene工具），并与已发表的墨西哥钝口螈单细胞研究数据（如Leigh等人2018年的研究）进行交叉验证，来推断其细胞类型（如表皮细胞、成纤维样细胞、内皮细胞）。

四、 主要研究结果

第一部分结果：外周免疫细胞鉴定 通过单细胞测序和聚类分析，从血液和腹腔细胞样本中成功鉴定出7个不同的细胞群体，并基于高表达的特异性基因将其注释为： 1. 群体1：血小板：高表达血小板特异性基因，如gp1ba, gp1bb, gp9, gucy1b3, *thbs1*。 2. 群体2：B细胞：高表达核糖体蛋白基因和免疫球蛋白基因*igll5*和*igj*。 3. 群体3：T细胞：高表达T细胞受体α链基因*trac*和颗粒酶B基因*gzmb*。 4. 群体4：红细胞：高表达多种血红蛋白基因（hbb, hba, *hbg1*）和血红素合成酶基因*alas2*。 5. 群体5：中性粒细胞：高表达*cebpe*（中性粒细胞分化的关键转录因子）、*mmp1*、*camp*、*chit1*等已知的中性粒细胞标志物。 6. 群体6：巨噬细胞：该群体仅出现在样本2（含腹腔细胞）中，高表达*fabp1*、*siglec1*、*marco*、*c1qb*、*c1qc*等巨噬细胞相关基因，证实了腹腔是巨噬细胞的来源。 7. 群体7：髓系样细胞：表达多种髓系免疫细胞标志物，如*cybb*、*cyba*、*gpx1*，可能包含单核细胞或其他未完全分化的髓系细胞。

这部分结果为后续分析再生肢体中的免疫细胞提供了关键的基因表达“参考图谱”。

第二部分结果：再生肢体早期细胞组成与动态变化 对1 dpa和6 dpa肢体残端细胞的测序分析，鉴定出8个主要细胞群体： 1. 群体1：红细胞：占测序细胞总数的绝大部分（约66%，共11，390个细胞），高表达血红蛋白基因。 2. 群体2：巨噬细胞：其显著富集基因与来自腹腔的巨噬细胞群体有69%的重叠（包括*siglec1*）。关键动态：在6 dpa的细胞数量是1 dpa的18.8倍，表明巨噬细胞在再生早期持续浸润并数量显著增加。 3. 群体3：淋巴细胞：同时表达T细胞标志物*trac*和B细胞标志物*igll5*，未能像外周血那样区分出独立的T细胞和B细胞群体，提示在再生早期微环境中，这两类细胞可能具有相似的转录状态。 4. 群体4：中性粒细胞：其显著富集基因与外周血中性粒细胞有65%的重叠。关键动态：在1 dpa的细胞数量是6 dpa的5.6倍，表明中性粒细胞在损伤后早期快速、大量浸润，随后数量下降。 5. 群体5和7：表皮细胞：两个群体均富集上皮发育相关的GO条目，并表达已知的表皮细胞标志基因，如krt5, *krt17*。它们可能代表了不同状态或来源的表皮细胞。 6. 群体6：成纤维样细胞：这是本研究的一个重要发现。该群体高表达细胞外基质成分基因（如lum, col3a1, dcn, *col5a2*）以及其他在结缔组织成纤维细胞中典型的基因。许多基因与Leigh等人（2018）研究中注释的“成纤维样芽基细胞”重叠。关键动态：在6 dpa的细胞数量是1 dpa的约13倍，且该群体是唯一显著富集细胞增殖标志物*pcna*的非免疫细胞群体。 7. 群体8：内皮细胞：高表达内皮细胞标志基因，如vwf, plvap, mmrn1, egfl7, *cd34*，并富集细胞粘附和血管生成相关的GO条目。

结果间的逻辑关系：首先，通过建立外周免疫细胞的基因表达谱，为鉴定肢体中的免疫细胞提供了可靠的分子标签。其次，将这套标签应用于再生肢体样本，成功识别出了浸润的免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞），并精确量化了它们随时间的变化规律（中性粒细胞早峰、巨噬细胞晚增）。最后，在排除大量红细胞后，成功鉴定出包括成纤维样细胞在内的多种非免疫基质细胞，并发现了成纤维样细胞在早期显著扩增的现象。

五、 研究结论与意义

本研究成功利用单细胞测序技术，首次在墨西哥钝口螈中系统性地建立了外周免疫细胞的转录组图谱，并揭示了在肢体再生早期（1-6 dpa），损伤部位免疫细胞和非免疫细胞的动态变化。主要结论与价值如下：

1. 构建了再生模型免疫细胞图谱：明确了墨西哥钝口螈外周血中血小板、B细胞、T细胞、红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和髓系样细胞的基因表达特征，为后续研究提供了宝贵的基因资源。
2. 揭示了再生早期免疫细胞浸润的时序规律：证实了在墨西哥钝口螈肢体再生中，也存在与其他脊椎动物相似的免疫细胞招募模式——中性粒细胞在损伤后早期（1 dpa）占主导，随后数量减少；而巨噬细胞则从早期开始持续增加，在6 dpa时成为更主要的免疫细胞类型。这种重叠但动态变化的模式对协调早期炎症反应和组织修复至关重要。
3. 发现了一个关键的早期成纤维样细胞群体：研究鉴定出一个在1 dpa至6 dpa期间数量急剧增加（13倍）的成纤维样细胞群体。该群体表达多种细胞外基质和间质细胞标志物，并且是唯一显示增殖活性的非免疫细胞群体。结合前人研究（Leigh et al., 2018）指出类似细胞是多能祖细胞，本研究提出重要假设：这些快速增殖的成纤维样细胞是关键的、先驱性的祖细胞群体，在截肢后被迅速激活，可能通过创建支持性微环境（niche）来启动芽基（blastema）的形成。
4. 提供了深入研究的分子工具：研究所鉴定的各细胞类型的富集基因集，将为未来更深入的单细胞研究、细胞谱系追踪和功能验证实验提供关键的分子靶点和分类依据。

六、 研究亮点

1. 研究策略的创新性：首次在墨西哥钝口螈再生研究中，采用“先外周鉴定，后组织验证”的策略。通过富集和测序外周免疫细胞（包括从腹腔获取巨噬细胞），建立了可靠的细胞类型参考数据库，从而更准确、无偏倚地解析了复杂再生组织中的细胞组成。
2. 重要的时空动态发现：精确量化了再生最初一周内关键免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）和非免疫细胞（成纤维样细胞）的丰度变化，将细胞行为与再生早期事件在时间轴上关联起来。
3. 提出具有启发性的新假说：基于成纤维样细胞在芽基明显形成之前（6 dpa）就出现显著扩增的现象，提出了该群体可能是“芽基先驱细胞”的假说，为理解芽基细胞的起源和早期激活机制提供了新的研究方向。
4. 技术与数据的可靠性：研究产生了深度的单细胞测序数据（每个文库数千个细胞，数千个独特分子），并通过与已发表研究的基因标志物交叉验证，确保了细胞注释的可靠性，增强了结果的普适性和可比性。

七、 其他有价值的要点

研究也坦诚地指出了其局限性：1）未能捕获所有预期的肢体细胞类型（如肌肉细胞、施旺细胞），可能由于某些大型细胞或稀有细胞与10x Genomics平台的兼容性问题或分离方法有待优化。2）鉴于成本，每个时间点仅分析了一个生物学样本，尽管测序细胞总数超过此前类似研究。然而，作者指出，在不同研究中使用不同方法能观察到一致的基因表达模式，这反过来证明了单细胞测序技术的稳健性和墨西哥钝口螈再生模型的可重复性。这些说明体现了研究的严谨性，并为未来研究指明了改进方向。