本文介绍了一项关于SP6 RNA聚合酶（SP6 RNA polymerase）表达与纯化方法的原创研究。该研究由Sergey A. Zozulya、Sergey A. Vishnivetskiy和Vsevolod V. Gurevich共同完成，其中前两位作者贡献相同。Sergey A. Zozulya来自乌克兰基辅的Enamine Ltd.，Sergey A. Vishnivetskiy和Vsevolod V. Gurevich来自美国范德堡大学（Vanderbilt University）药理学系。该论文发表于Preparative Biochemistry & Biotechnology期刊，于2026年11月1日在线发表，可通过DOI链接https://doi.org/10.¹⁰⁸⁰⁄_10826068.2026.2756446访问。

在学术背景方面，该研究属于分子生物学与蛋白质工程领域，重点关注无细胞蛋白表达（cell-free protein expression）系统中mRNA的体外转录（in vitro transcription）。在许多结构生物学、生物化学和生物物理学研究中，蛋白质往往需要在异源系统中表达并纯化。无细胞表达系统能够避免细胞表达中存在的一些问题，例如毒性蛋白或肽的生产、非天然氨基酸的定点掺入以及对大量设计蛋白变体的快速测试等。无细胞表达系统分为同时进行转录和翻译的系统以及转录和翻译分开进行的系统。对于后者，大规模生产高质量mRNA是必要条件。在此过程中，来源于噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶被广泛使用，其中SP6噬菌体RNA聚合酶因其产生的未加帽mRNA在无细胞翻译中可获得比T7等其他聚合酶更高的蛋白产量而受到关注。然而，此前SP6 RNA聚合酶的大规模纯化方法主要依赖从感染SP6噬菌体的沙门氏菌中提取，操作复杂且需要特殊设备，而商业化的重组SP6 RNA聚合酶虽可用但价格较高且表达纯化方法未公开。因此，本研究旨在构建一种高效的大肠杆菌表达载体，建立简便的纯化流程，以获得高活性、高稳定性且成本较低的SP6 RNA聚合酶，从而降低体外转录和无细胞蛋白表达的成本。

在研究方法和工作流程方面，本研究主要包括载体构建、表达与细胞裂解、磷酸纤维素层析（cellulose phosphate chromatography）、蓝色琼脂糖层析（blue sepharose chromatography）、透析与保存以及酶活性测定等步骤。首先，研究者构建了名为pTISP6的细菌表达质粒，该质粒大小为5908 bp，以pTIS1DT载体为骨架，含有λ噬菌体PR启动子和热敏λ阻遏蛋白突变体，可在37°C条件下通过温度诱导实现高效表达。SP6 RNA聚合酶的开放阅读框从中间克隆质粒pUSP6中切下，插入到pTIS1DT的BglII和SacI位点。该质粒的抗生素抗性标记为氨苄青霉素抗性。在表达与细胞裂解阶段，使用大肠杆菌HB101菌株转化pTISP6，先在30°C培养至对数期，然后转移至37°C继续培养3小时以诱导表达。细胞经离心收集后重悬于含有Tris-HCl、DTT、EDTA等成分的缓冲液中，加入溶菌酶进行裂解，再通过超声破碎。裂解液经超速离心分离上清，随后加入硫酸链霉素至终浓度0.2%以沉淀核酸，离心后在上清中加入硫酸铵至0.4 g/mL进行蛋白沉淀。沉淀可于-80°C冻存。在磷酸纤维素层析阶段，将硫酸铵沉淀溶解于低盐缓冲液并稀释后上样至磷酸纤维素柱。该层析是一种阳离子交换层析，能够优先结合磷酸结合蛋白。用含150 mM和250 mM NaCl的缓冲液逐步洗脱杂质，最后用含500 mM NaCl的缓冲液洗脱SP6聚合酶，收集各组分。在蓝色琼脂糖层析阶段，使用自制蓝色琼脂糖树脂，该树脂通过将蓝色葡聚糖与CNBr活化的琼脂糖4B偶联制备，染料含量约为0.1 µmol/mL，这一条件对于SP6聚合酶的可逆结合和有效洗脱至关重要。将磷酸纤维素层析的合并峰组分稀释至约250 mM NaCl后上样至蓝色琼脂糖柱，依次用含ATP/GTP的缓冲液和平衡缓冲液洗涤，最后用高浓度磷酸钾缓冲液洗脱SP6聚合酶。收集的峰组分经透析去除盐分并置换至含50%甘油的保存缓冲液中，分装后于-20°C保存。在活性测定方面，以线性化质粒为模板，在38°C下反应30分钟，通过LiCl沉淀和分光光度法定量生成的RNA，酶活单位定义为每小时掺入1 nmol每种核苷酸所需的酶量。

在研究结果方面，研究者首先验证了pTISP6在大肠杆菌HB101中的表达效果。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色发现，37°C诱导后细胞裂解液中出现了明显的SP6 RNA聚合酶条带，分子量略低于100 kDa标记，且约有一半的蛋白存在于可溶性上清中。随后，通过磷酸纤维素层析去除了大量杂蛋白，主要组分中仅有少量污染物。蓝色琼脂糖层析进一步去除了剩余杂质，得到了几乎纯的SP6 RNA聚合酶。最终从2.4升细菌培养物中获得了约6 mg的SP6聚合酶，溶于约10 mL保存缓冲液中，酶活性为176.2±8.3 U/µL（n=3），总活性超过1,760,000单位。纯化后的SP6聚合酶在-20°C条件下半衰期约为10年，远高于商业SP6聚合酶的稳定性。此外，文章还讨论了在电泳过程中处理高盐或高甘油样品时的注意事项，建议使用甲醇沉淀以去除干扰，以及在体外转录中使用高缓冲容量条件和添加无机焦磷酸酶以提高mRNA产量。这些结果共同表明，该纯化方法能够获得高纯度、高活性和高稳定性的SP6 RNA聚合酶，并且整个流程可在普通实验室中轻松完成。

在结论和意义方面，该研究成功建立了从大肠杆菌中高效表达和纯化无标签SP6 RNA聚合酶的方法，利用磷酸纤维素和蓝色琼脂糖两步层析即可从2.4升培养物中获得超过150万单位的酶。该酶在-20°C保存条件下可保持活性多年，单次纯化即可满足一般实验室多年体外转录需求。由于SP6聚合酶转录产生的未加帽mRNA的5′端序列为5′-GAATACA…，其在无细胞翻译系统中的蛋白产量比T7聚合酶产生的未加帽mRNA高数倍，因此使用该酶合成未加帽mRNA可显著提高无细胞蛋白表达的效率并降低成本。此外，该方法避免了商业SP6聚合酶的高昂价格和未公开的生产工艺，为无细胞蛋白表达系统在结构生物学、生物化学以及蛋白质设计等领域的广泛应用提供了可行且经济的支持。

本研究的亮点在于：首次公开了重组SP6 RNA聚合酶在大肠杆菌中的表达载体构建和详细纯化流程；使用了自制蓝色琼脂糖树脂并强调了低染料含量对酶可逆结合和洗脱的重要性；获得的SP6聚合酶具有极高的比活性和长期稳定性；利用SP6聚合酶产生特定5′端序列的未加帽mRNA可显著提高无细胞翻译的蛋白产量，从而降低体外mRNA生产的成本。这些特点使得该研究在方法学上具有重要的参考价值和应用前景。