学术研究报告：长链非编码RNA（lncRNA）通过启动子、转录和剪接调控邻近基因表达的局部机制

作者与发表信息

本研究由Jesse M. Engreitz（Broad Institute of MIT and Harvard）、Jenna E. Haines（加州大学伯克利分校）、Mitchell Guttman（加州理工学院）等共同完成，发表于2016年11月17日的《Nature》期刊（Volume 539），DOI编号10.1038/nature20149。

学术背景

哺乳动物基因组广泛转录产生数千种长链非编码RNA（lncRNA, long non-coding RNA），但其功能机制尚未完全阐明。此前研究表明，少数lncRNA可通过RNA-蛋白质相互作用招募调控复合物，影响邻近基因表达（即顺式调控, cis-regulation）。然而，lncRNA表达与邻近基因的相关性可能源于转录过程本身（如启动子的增强子活性或转录介导的染色质重塑），而非lncRNA转录产物的特异性功能。本研究旨在通过遗传学手段系统解析12个lncRNA和6个蛋白质编码基因（mRNA）位点，明确其调控邻近基因的机制是否依赖RNA产物本身。

研究流程与方法

1. 实验设计与模型系统

• 研究对象：小鼠胚胎干细胞（mES细胞），选用129/Castaneus F1杂交品系，利用其高密度单核苷酸多态性（SNP）区分等位基因特异性表达。
  
• 靶基因选择：
  
  • lncRNA：筛选12个核富集的lncRNA，覆盖不同表达水平，优先选择与邻近基因表达相关的位点（如linc1536、linc1319）。
    
  • mRNA：选择6个蛋白质编码基因作为对照（如sfmbt2、slc30a9）。
    

2. 遗传操作与功能验证

• 启动子敲除（Promoter knockout）：通过CRISPR-Cas9删除lncRNA或mRNA启动子区域（约600–1000 bp），构建杂合和纯合敲除克隆。
  
  • 等位基因特异性分析：比较修饰染色体（cis）与未修饰同源染色体（trans）上邻近基因的表达变化，区分局部效应与间接效应。
    
• 转录终止信号插入（PAS insertion）：在转录起始位点（TSS）下游0.5–3 kb插入多聚腺苷酸化信号（PAS, polyadenylation signal），提前终止转录但不破坏启动子序列，以测试RNA产物是否必需。
  
• 外显子与内含子删除：针对特定lncRNA（如linc1319/blustr），删除单个外显子或5’剪接位点，验证剪接过程的作用。
  

3. 多组学数据分析

• RNA测序（RNA-seq）：通过杂交捕获技术富集靶基因附近的SNP区域，量化等位基因特异性表达。
  
• 全局核连缀测序（GRO-seq）：检测转录延伸的RNA聚合酶分布，验证转录活性变化。
  
• 染色质免疫沉淀（ChIP-seq）：分析H3K4me3（启动子标记）、H3K27me3（抑制性标记）等组蛋白修饰。
  
• 染色质可及性（ATAC-seq）：评估调控区域的开放性变化。
  

4. 进化保守性分析

• 通过跨物种比对（小鼠、人类、大鼠）评估lncRNA启动子序列的保守性，结合人类胚胎干细胞的表观遗传数据（如DNase超敏感位点），分析其是否具有跨物种增强子功能。
  

主要结果

1. lncRNA位点的顺式调控普遍存在

• ⁵⁄₁₂ lncRNA位点和⁴⁄₆ mRNA位点的启动子敲除显著影响邻近基因表达（距离5–71 kb），表明局部调控是普遍现象。
  
• 机制分类：
  
  • 增强子样启动子（如linc1536/bendr）：删除启动子降低邻近基因bend4表达57%，但插入PAS（终止转录）无影响，表明调控依赖DNA元件而非RNA产物。
    
  • 转录与剪接依赖（如linc1319/blustr）：删除启动子或5’剪接位点均导致邻近基因sfmbt2表达下降85%，提示剪接体招募转录机器激活sfmbt2。
    

2. RNA产物的非必需性

• 在多数案例中，lncRNA转录本本身并非调控必需条件。例如，bendr的成熟RNA被PAS截断后，bend4表达未受影响。
  
• 仅blustr位点显示剪接过程通过增加局部转录因子浓度间接激活sfmbt2（如染色质重塑和RNA聚合酶暂停释放）。
  

3. 进化意义

• 部分lncRNA启动子在人类中保守且具有增强子表观特征（如H3K4me1/DNase超敏感），但其转录本在进化中未保守，提示这些位点可能以DNA调控元件而非RNA功能被选择。
  

结论与意义

本研究揭示了基因位点的多功能性：
1. RNA产物功能（如mRNA翻译或lncRNA分子作用）；
2. 转录相关过程功能（如启动子增强子活性、转录延伸或剪接介导的局部调控）。
这一发现为lncRNA的进化起源提供了新视角——某些lncRNA可能是调控性转录的副产物，其保守性源于DNA序列的顺式调控功能而非RNA本身。

研究亮点

• 方法创新：结合等位基因特异性CRISPR编辑与多组学分析，精准区分顺式/反式效应。
  
• 范式转变：挑战了“lncRNA功能必须依赖RNA产物”的传统假设，提出转录过程本身可作为独立调控层。
  
• 跨物种价值：揭示了基因组中“隐性”调控元件的保守逻辑，为非编码区域的功能注释提供新框架。
  

补充价值

研究还暗示，基因邻域内的“交叉对话”可能影响疾病相关基因簇（如印记基因或致癌位点）的协同表达，为复杂性状遗传学研究提供了机制线索。