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作者与机构
本研究由Igor Fesenko、Harutyun Sahakyan、Rajat Dhyani、Svetlana A. Shabalina、Gisela Storz和Eugene V. Koonin等作者共同完成。研究团队来自美国国立卫生研究院（NIH）下属的多个机构，包括国家医学图书馆（NLM）的计算生物学分支、尤尼斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）的分子与细胞生物学部门。研究于2025年3月6日发表在《Molecular Cell》期刊上，题为“The Hidden Bacterial Microproteome”。
学术背景
本研究属于微生物学和计算生物学领域，聚焦于细菌基因组中由小开放阅读框（smORFs, small open reading frames）编码的微蛋白（microproteins）。尽管微蛋白在所有生命域中均有发现，但其功能特性尚未得到充分研究。细菌基因组中的基因间区域（IGRs, intergenic regions）可能编码大量未被注释的微蛋白，这些微蛋白可能在细菌的生理功能中发挥重要作用。本研究旨在通过大规模计算分析和实验验证，揭示细菌微蛋白组的多样性和功能，并提供一个公开可用的资源，帮助进一步研究微蛋白的功能。
研究流程
研究流程分为以下几个主要步骤：
1. 微蛋白预测与筛选
研究团队分析了来自肠杆菌科（Enterobacteriaceae）家族的5,668个细菌基因组中的基因间区域（IGRs），筛选出长度在15至70个密码子之间的潜在微蛋白编码序列（iSMORFs, intergenic smORFs）。使用两种独立的方法（RNACode和EvolScore）评估这些序列的编码潜力，并通过随机森林算法进一步验证预测结果。最终，研究团队预测了67,297个微蛋白家族，并命名为“Entero67k”。
2. 转录与翻译分析
通过重新分析公开的RNA测序（RNA-seq）数据，研究团队验证了部分iSMORFs的转录活性。此外，通过核糖体测序（Ribo-seq）和质谱分析（MS），研究团队进一步验证了部分微蛋白的翻译活性。结果显示，约50%的iSMORFs在转录水平上被检测到，而约6.5%的iSMORFs在翻译水平上被检测到。
3. 微蛋白结构与功能预测
使用AlphaFold2（AF2）预测了部分微蛋白的三维结构，并结合进化保守性和基因组上下文分析，推测了这些微蛋白的功能。研究发现，大多数微蛋白具有简单的α螺旋结构，部分微蛋白可能通过同源寡聚化（homo-oligomerization）形成更复杂的结构。
4. 实验验证
研究团队选择了16个预测的微蛋白进行实验验证，通过将SPA标签（Sequential Peptide Affinity tag）整合到大肠杆菌染色体中，检测这些微蛋白的表达。结果显示，11个微蛋白在指数生长期或稳定期被成功检测到，验证了预测的准确性。
主要结果
1. 微蛋白多样性
研究预测了67,297个微蛋白家族，其中大多数是谱系特异性的，反映了细菌蛋白组的多样性。这些微蛋白的长度中位数为27个氨基酸，且具有较高的疏水性。
2. 转录与翻译验证
通过RNA-seq和Ribo-seq分析，研究团队验证了部分iSMORFs的转录和翻译活性。转录水平上，约50%的iSMORFs被检测到；翻译水平上，约6.5%的iSMORFs被检测到。
3. 结构与功能预测
使用AlphaFold2预测了部分微蛋白的结构，发现大多数微蛋白具有简单的α螺旋结构，部分微蛋白可能通过同源寡聚化形成更复杂的结构。研究还预测了部分微蛋白与邻近基因编码蛋白的相互作用，推测这些微蛋白可能通过调控其他蛋白的功能发挥作用。
4. 实验验证结果
实验验证了11个预测的微蛋白的表达，其中部分微蛋白的表达水平在不同生长条件下发生变化，表明这些微蛋白可能参与细菌的应激响应。
结论与意义
本研究揭示了细菌微蛋白组的多样性和功能，提供了一个全面的资源，帮助进一步研究微蛋白的功能。研究结果表明，细菌基因组中可能存在大量未被注释的微蛋白，这些微蛋白可能在细菌的生理功能和应激响应中发挥重要作用。此外，本研究还展示了通过计算预测和实验验证相结合的方法，可以有效揭示微蛋白的功能特性。这一研究为细菌微蛋白组的研究提供了重要的理论基础和实验工具。
研究亮点
1. 大规模预测与验证
研究团队通过大规模计算分析预测了67,297个微蛋白家族，并通过实验验证了部分微蛋白的表达，展示了细菌微蛋白组的多样性。
2. 结构与功能预测
使用AlphaFold2预测了部分微蛋白的结构，并推测了这些微蛋白的功能，为理解微蛋白的作用机制提供了新的视角。
3. 资源公开
研究团队提供了一个公开可用的资源，包括微蛋白的预测结果、结构信息和实验验证数据，为后续研究提供了重要的参考。
其他有价值的内容
研究团队还探讨了微蛋白的进化起源，推测许多微蛋白可能是从非编码序列中从头（de novo）进化而来的。这一发现为理解蛋白质的进化机制提供了新的线索。此外，研究还预测了部分微蛋白与邻近基因编码蛋白的相互作用，推测这些微蛋白可能通过调控其他蛋白的功能发挥作用，为细菌的生理功能研究提供了新的研究方向。
这篇报告详细介绍了研究的背景、流程、结果和意义，为读者提供了一个全面的学术视角。