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白杨茎段愈伤组织诱导与不定器官发生的调控网络综合分析

作者及机构
本研究由东北林业大学和中国林业科学研究院国家林木遗传育种重点实验室的Xiao-Yuan Li、Gui-Feng Liu、Qing-Yin Zeng和Yan-Jing Liu*（通讯作者）团队完成，发表于国际期刊*International Journal of Molecular Sciences*（*Int. J. Mol. Sci.*）2025年4月25日第26卷第9期，文章编号4087，DOI: 10.3390/ijms26094087。

研究背景

科学领域与动机
白杨（Populus alba L.）是生态保护及工业用材的重要树种，也是林木科学研究的模式物种。离体再生技术因其高效繁殖特性成为林木无性繁殖的关键手段，但此前对杨树再生过程中激素调控网络与转录层级的全面解析仍不清晰。本研究通过整合内源激素动态、生理特性及转录组数据，旨在揭示白杨茎段愈伤组织诱导与不定器官发生的调控机制。

理论基础
前人研究表明，生长素（auxin）和细胞分裂素（cytokinin）的协同作用是植物离体再生的核心驱动力。例如，拟南芥中生长素通过激活*WOX11/12*和*LBD*家族基因促进愈伤形成，而细胞分裂素通过*WUS/ESR1*通路调控不定芽再生。然而，杨树的再生机制是否保守，以及多激素（如赤霉素GA、茉莉酸JA、油菜素内酯BR）如何参与此过程尚不明确。

研究目标
1. 追踪白杨茎段再生过程中内源激素的时序变化；
2. 鉴定关键代谢酶活性与转录调控因子；
3. 提出生长素-细胞分裂素介导的杨树再生通路模型。

研究方法与流程

1. 实验材料与再生体系构建
- 研究对象：白杨茎段切块（3–4 mm），接种于含0.1 mg/L NAA（萘乙酸）和0.2 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤）的MS培养基。
- 时间点设计：在0、3、5、7、9、12、15、23、29、33天取样，覆盖愈伤诱导（0–7天）和不定芽形成（12–33天）阶段。每个时间点设3个生物学重复（激素分析）或5个重复（生理指标）。

2. 内源激素定量分析
- 技术方法：采用LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）检测11类激素（如生长素IAA、细胞分裂素BAP、赤霉素GA53等）及其代谢物。
- 关键步骤：样本经甲醇/水/甲酸（15:4:1）提取，同位素内标校正，通过多反应监测（MRM）模式定量。

3. 代谢酶活性测定
- 靶标酶：吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、细胞分裂素氧化酶（CKX）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）。
- 检测试剂盒：使用南京建成和北京博奥等商业化试剂盒，测定酶活性单位（如IAAO以U/g表示）。

4. 转录组分析
- 测序策略：对0、7、12天的样本进行RNA-seq（Illumina平台），比对白杨基因组（*Palba_v2.0*）。
- 差异基因筛选：采用DESeq2（padj < 0.05且|log2FC| ≥ 2），GO富集分析通过ClusterProfiler完成。

5. 关键基因鉴定
- 候选基因：基于拟南芥和毛果杨（*Populus trichocarpa*）的已知激素相关基因，通过BLAST比对筛选白杨同源基因（如*WOX11/12*、*CUC1/2*）。

主要结果

1. 激素动态与再生阶段关联
- 生长素途径：愈伤诱导期（0–7天），IAA前体色氨酸（Trp）和储存形式IAA-Glc显著积累，而活性IAA在切割后迅速降解；不定芽形成期（12天后），IAA-Glc再次升高，代谢产物IAA-Glu/IAA-Asp增加，提示IAA合成与代谢通路激活。
- 细胞分裂素途径：活性BAP在愈伤期持续下降，而其前体BAPR和糖苷代谢物BAP9G在不定芽期峰值出现（12天），表明细胞分裂素需求剧增。
- 其他激素：JA在愈伤期后（>12天）积累，可能与芽再生相关；赤霉素前体GA53/GA19在早期短暂升高后持续降低，印证GA抑制再生的假说。

2. 代谢酶活性变化
- IAAO与CKX：愈伤期IAAO活性降低（59.3 U/g），而CKX在不定芽期回升（267 nmol/min/g），反映激素稳态调控。
- POD与PAL：POD活性在愈伤期达峰值（480 U/g），与细胞氧化还原平衡相关；PAL在芽再生时骤升（22.6 U/g），暗示木质素合成参与器官发生。

3. 转录调控网络
- 关键上调基因：
- *WOX11/12*（log2FC=9.87）：介导生长素信号，启动细胞命运转化；
- *CUC1/2*（log2FC=10.18）：12天后激活顶端分生组织（SAM） initiation；
- *ESR1*和*WUS*：受细胞分裂素诱导，调控不定芽形成。
- 通路富集：GO分析显示“生长素激活信号通路”“细胞周期调控”等显著富集，与激素表型数据一致。

结论与价值

科学意义
1. 首次提出白杨再生中生长素-细胞分裂素协同作用的分子模型：*WOX11/12-ARF5*启动愈伤形成，*CUC1/2*触发SAM initiation，*ESR1/WUS*完成器官发生。
2. 揭示JA和BR等激素的阶段性调控功能，拓展了多激素互作理论的认知。

应用潜力
该研究为杨树高效遗传转化体系的优化提供靶点基因（如*WOX11/12*），并助力林木无性繁殖技术的精准调控。

研究亮点

1. 多组学整合：首次将激素代谢组、酶活动力学与转录组结合，全面解析杨树再生机制。
   
2. 关键基因发现：鉴定*CUC1/2*在白杨不定芽发生中的核心作用，填补木本植物研究的空白。
   
3. 技术严谨性：采用LC-MS/MS高灵敏度定量，数据覆盖11类激素及其代谢物。
   

补充价值
实验数据已上传至国家基因组科学数据中心（Bioproject PRJCA035821），为后续研究提供资源。