学术研究报告：将大肠杆菌改造为仅依赖甲醇生长的合成甲基营养菌

一、作者与发表信息
本研究由台湾中央研究院生物化学研究所的Frederic Y.-H. Chen、Hsin-Wei Jung、Chao-Yin Tsuei和James C. Liao（通讯作者）团队完成，发表于Cell期刊2020年8月20日第182卷，标题为《Converting Escherichia coli to a Synthetic Methylotroph Growing Solely on Methanol》。研究通过理性设计与实验室进化，首次实现了大肠杆菌（*Escherichia coli*）以甲醇为唯一碳源的高效生长，为C1生物转化提供了新范例。

二、学术背景
科学领域：本研究属于合成生物学与代谢工程领域，聚焦于微生物碳源代谢途径的重编程。
研究动机：甲醇因其高电子密度及可从甲烷或CO₂衍生的特性，被视为潜在的可再生单碳（C1）原料。然而，天然甲基营养菌（如*Methylobacterium extorquens*）的甲醇利用效率低，且非甲基营养菌（如大肠杆菌）缺乏完整的甲醇同化途径。尽管此前研究尝试通过引入异源基因（如甲醇脱氢酶*medh*、己酮糖-6-磷酸合成酶*hps*和6-磷酸-3-己酮糖异构酶*phi*）改造大肠杆菌，但改造后的菌株仍需依赖其他碳源或生长缓慢（倍增时间55小时，最大OD₆₀₀仅0.2）。
研究目标：通过代谢网络优化与进化工程，构建一株仅依赖甲醇生长的高效合成甲基营养菌，并解决甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DNA-protein crosslinking, DPC）问题。

三、研究流程与方法
1. 甲醇营养缺陷型菌株构建
- 对象与样本：以大肠杆菌BW25113 Δ*rpiAB*为底盘，通过CRISPR-Cas9系统敲除磷酸戊糖途径基因*rpiAB*，并整合两个合成操纵子（含*medh*、*hps*、*phi*、转酮醇酶*tkt*和转醛缩酶*tal*）。
- 进化策略：在含甲醇和木糖的培养基中连续传代80代，筛选出甲醇营养缺陷型菌株CFC381.20。全基因组测序发现关键突变：甲醛解毒基因*frmA*失活、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶*gnd*截短，表明进化方向为减少甲醛流失至CO₂的竞争途径。

1. 合成甲基营养菌的理性设计与进化

   • 代谢稳健性分析（EMRA）：通过扰动酶活性参数（0.1–10倍变化），识别导致系统不稳定的关键节点。结果显示磷酸果糖激酶（PFK）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的高活性会分流碳流，阻碍核酮糖-5-磷酸（Ru5P）再生。
     
   • 基因组编辑：敲除*pfkA*（占PFK活性的90%），并用活性较低的BL21菌株*gapC*替换*gapA*，构建菌株CFC526.0。
     
   • 实验室进化：逐步减少培养基中氨基酸混合物（HDA）比例，最终获得仅依赖甲醇生长的菌株CFC680.1（倍增时间41小时）。进一步进化后，菌株CFC680.20的倍增时间缩短至8.5小时，最大OD₆₀₀达2。

2. 甲醛毒性机制解析与解决

   • DPC现象验证：通过透射电镜（TEM）和定量蛋白质组学，证实甲醛在静止期导致DNA-蛋白质交联，形成网状结构（图4c）。共鉴定61种高丰度交联蛋白，主要为核糖体和外膜蛋白。
     
   • 拷贝数变异（CNV）的作用：长读长测序（PacBio/Nanopore）发现70 kb区域（含*rump*途径基因和糖酵解基因）的串联重复（4拷贝）。动态CNV分析显示，该区域拷贝数与甲醇生长速率正相关（图6e），且在LB培养基中拷贝数降低，甲醇培养基中恢复。

3. 菌株分离与功能验证

   • 纯化甲基营养菌SM1：通过单菌落PCR分离，验证其可在50 mM–1.2 M甲醇中生长，最佳浓度400 mM（图7f）。¹³C标记实验证实甲醇为唯一碳源，产物为甲酸和乙酸（图3d-e）。
     
   • 关键突变验证：回补实验显示，恢复*frmA*、*gapA*或*pfkA*会显著抑制生长，证实突变必要性。

四、主要结果与逻辑链条
1. 甲醇同化途径的建立：通过*rump*循环（仅需3个异源酶）实现甲醇至生物质的转化，但需平衡Ru5P再生与甲醛通量。
2. 进化驱动的代谢优化：*frmA*失活迫使甲醛进入生物合成途径；*gnd*截短减少NADPH浪费；*pgi*的12 bp缺失提升6-磷酸葡萄糖异构酶活性，促进NADPH生成。
3. CNV的动态适应：70 kb区域的拷贝数变化（3–5.6倍）调节代谢通量，解决PFK与GAPDH的瓶颈问题。
4. DPC的生物学意义：揭示了甲醛毒性对合成甲基营养菌的限制，为后续工程提供靶点。

五、结论与价值
科学价值：
- 首次实现大肠杆菌以甲醇为唯一碳源的高效生长（倍增时间8.5小时），媲美天然甲基营养菌。
- 揭示了甲醛诱导DPC的机制，提出CNV作为适应性进化新策略。
应用价值：
- 为工业微生物利用甲醇生产化学品（如乙醇、乙酰辅酶A衍生物）奠定基础。
- 扩展了C1生物转化的宿主范围，支持碳中和目标。

六、研究亮点
1. 创新方法：结合EMRA理性设计与实验室进化，解决了代谢网络平衡难题。
2. 关键发现：CNV动态调控代谢通量，首次报道细菌通过串联重复适应环境压力。
3. 跨学科意义：为合成生物学、进化生物学和代谢工程提供了交叉案例。

七、其他价值
研究还发现共生亚群（如非甲基营养菌BB1）可能通过利用SM1的代谢副产物（如乙酸）共存，暗示微生物群落协同进化的重要性。未来可进一步优化静止期代谢平衡，或引入甲烷单加氧酶（MMO）拓展至甲烷利用。