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分散固相印迹蛋白质以生产塑料抗体的新方法

期刊:Chemical CommunicationsDOI:10.1039/c8cc00343b

这篇文档属于类型a,即报告了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告:

作者及研究机构

本研究的主要作者包括Jon Ashley、Xiaotong Feng、Arnab Halder、Tongchang Zhou和Yi Sun。他们来自丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的微纳米技术系。该研究发表在《Chemical Communications》期刊上,出版时间为2018年。

学术背景

本研究的主要科学领域是分子印迹技术(Molecularly Imprinted Polymers, MIPs),特别是用于蛋白质印迹的纳米分子印迹聚合物(nanomips)的合成。天然抗体由于其高亲和性和选择性,在生物分子识别中被广泛应用,但其生产成本高且稳定性差。因此,开发替代性抗体模拟物成为研究热点。分子印迹聚合物(MIPs)是一种合成的亲和剂,能够针对多种分析物进行定制。然而,蛋白质的印迹仍然是一个重大挑战,尤其是模板的去除问题。本研究旨在开发一种新的分散固相印迹技术,以高效合成高亲和性和无模板的纳米分子印迹聚合物。

研究流程

研究分为以下几个步骤:

  1. 磁性微球的合成
    首先,采用热溶剂法合成了260 nm大小的氧化铁核心,然后通过溶胶-凝胶法添加了200 nm的SiO₂层。接着,通过表面接枝环氧基团对微球进行修饰。磁性微球的直径为600-700 nm,具有较高的表面体积比,从而实现了更高的模板固定化程度。

  2. 蛋白质模板的固定化
    使用胰蛋白酶(trypsin)作为模型模板,通过胺偶联反应将蛋白质固定到环氧基团修饰的磁性微球上。固定化程度通过BCA蛋白测定法进行表征,结果显示每克微球固定了237 nmol的蛋白质,比传统玻璃珠固定化程度提高了140倍。

  3. 分散固相印迹
    将固定化蛋白质的磁性微球分散到反应混合物中,进行水凝胶基沉淀聚合反应。反应中使用了丙烯酸(ACC)和N-四丁基丙烯酰胺(TBAM)作为功能单体,N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)作为骨架单体,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)作为交联剂,并添加了N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)盐酸盐以引入伯胺基团。反应在恒定轨道搅拌下进行,聚合完成后通过磁铁收集微球-MIP结合物,并通过热水洗涤去除未反应的单体和低亲和性纳米颗粒。

  4. 纳米分子印迹聚合物的表征
    通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)对合成的纳米分子印迹聚合物进行表征,结果显示其平均尺寸为200-220 nm,尺寸分布均匀。产量为每克微球25 mg MIP,比传统固相合成提高了83-167倍。

  5. 亲和性和选择性测试
    使用表面等离子体共振(SPR)技术对纳米分子印迹聚合物与胰蛋白酶的亲和性进行表征。结果显示,纳米分子印迹聚合物对胰蛋白酶的Kd值为2×10⁻⁷ M,表明其具有高亲和性。选择性测试表明,纳米分子印迹聚合物对胰蛋白酶的选择性显著高于其他蛋白质(如RNase、β-乳球蛋白和血红蛋白)。

主要结果

  1. 磁性微球的合成与固定化
    成功合成了直径600-700 nm的磁性微球,并通过环氧基团修饰实现了高效的蛋白质固定化。每克微球固定了237 nmol的蛋白质,比传统玻璃珠提高了140倍。

  2. 分散固相印迹技术的开发
    通过分散固相印迹技术,成功合成了高亲和性和无模板的纳米分子印迹聚合物。产量为每克微球25 mg MIP,比传统固相合成提高了83-167倍。

  3. 纳米分子印迹聚合物的表征
    TEM和DLS分析显示,纳米分子印迹聚合物具有均匀的球形结构,平均尺寸为200-220 nm。

  4. 亲和性和选择性测试
    SPR测试表明,纳米分子印迹聚合物对胰蛋白酶的Kd值为2×10⁻⁷ M,且对胰蛋白酶的选择性显著高于其他蛋白质。

结论

本研究成功开发了一种新的分散固相印迹技术,用于高效合成高亲和性和无模板的纳米分子印迹聚合物。该技术结合了自由溶液聚合和固相合成的优点,显著提高了产量和亲和性。通过使用磁性微球作为固相支持材料,本研究解决了传统玻璃珠固相合成中的低表面面积和模板去除问题。该技术不仅适用于蛋白质印迹,还可用于小分子印迹和表位印迹,具有广泛的应用前景。

研究亮点

  1. 新颖的分散固相印迹技术
    本研究首次提出并验证了分散固相印迹技术,显著提高了纳米分子印迹聚合物的产量和亲和性。

  2. 磁性微球的应用
    通过使用磁性微球作为固相支持材料,本研究实现了高效的蛋白质固定化和模板去除,解决了传统玻璃珠固相合成中的问题。

  3. 高亲和性和选择性
    合成的纳米分子印迹聚合物对胰蛋白酶具有高亲和性和选择性,表明其在生物分子识别中的潜在应用价值。

其他有价值的内容

本研究还展示了该技术的可扩展性,表明其适用于商业化生产。此外,作者计划进一步扩展该技术用于生物相关大分子的印迹,并研究化学方法和低温方法以回收高亲和性纳米分子印迹聚合物,从而实现固相支持材料的重复使用。

通过本研究,作者为分子印迹技术领域提供了新的思路和方法,推动了蛋白质印迹技术的发展。

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