本研究由Yonsei University的Young Jin Kim、Soo Hyun Ryu、Min Hyeong Kim，Osong Medical Innovation Foundation的Janghan Lee，CAD-IT Korea的Jae Cheol Lee，以及Chungbuk National University的Chun-Woong Park和Jong Kwang Hong等人共同完成。论文发表于*Biotechnology and Bioprocess Engineering*期刊，2025年5月24日在线发表，卷号为第30卷，页码759–775。
该研究的学术背景属于生物过程工程与计算流体力学（Computational Fluid Dynamics, CFD）的交叉领域。在生物制药早期工艺开发中，细胞株筛选和培养基优化通常采用摇瓶（shaking flasks）等高通量、低成本的小规模培养体系。然而，不同类型的摇瓶如旋转管（Tube Spin, TS）和锥形瓶（Erlenmeyer Flask, EF）在几何形状和尺寸上差异显著，其最佳操作条件长期依赖经验性试错。随着生物药模态日益多样化，不同规格和形状的摇瓶被引入工艺开发，但缺乏系统性的流体动力学理解，导致操作条件确定存在不确定性。因此，本研究旨在通过结合实验细胞培养数据和计算流体力学分析，系统表征不同摇瓶类型和尺寸在不同振荡速度下的水动力学特征及其对CHO细胞培养性能的影响，为优化小规模培养工艺和构建生物过程数字孪生模型奠定基础。
研究采用了系统的实验与模拟相结合的工作流程。首先，在实验部分，作者使用了表达单克隆抗体的CHO细胞系，在四种不同类型的摇瓶中进行批次培养，包括50 mL旋转管（TS）和125 mL、500 mL、1 L锥形瓶（EF），工作体积分别为15、40、160和320 mL。所有培养均在5% CO₂、95%湿度和37°C条件下进行，振荡速度从20 rpm到260 rpm以30 rpm为间隔共设置了九个条件，每个条件独立重复两次。实验过程中每天使用Vi-CELL XR细胞活力分析仪测量活细胞密度（Viable Cell Density, VCD）和细胞活力，使用Cedex HT分析仪定量抗体效价和代谢物（葡萄糖、乳酸、氨）浓度。随后，作者利用M-STAR软件版本3.10.32进行CFD模拟，采用格子Boltzmann方法（Lattice-Boltzmann Method, LBM）求解Navier-Stokes方程，湍流模型选用大涡模拟（Large Eddy Simulation, LES）。几何模型由M-STAR预处理器根据实际摇瓶尺寸构建，流体假设为牛顿流体，密度设为1000 kg/m³，运动粘度设为1×10⁻⁶ m²/s，摇瓶壁面采用无滑移边界条件，液面采用自由表面模型。模拟在NVIDIA GeForce RTX 3090 GPU上进行。在模拟过程中，待流场达到准稳态后引入染料示踪剂，以染料浓度相对标准偏差降至5%以下所需时间定义为混合时间。此外，作者计算了能量耗散率（Energy Dissipation Rate, EDR）、速度、剪切应力、涡量、体积氧传质系数kLa、表面积与体积比以及Kolmogorov长度尺度（Kolmogorov Length Scale, KLS）等关键水动力学参数。模型验证方面，作者进行了网格敏感性和时间分辨率敏感性分析，确保模拟结果对网格密度和时间步长的独立性，最终所有模拟采用的网格数均超过400万。
实验结果显示，细胞生长和抗体生产对摇瓶形状和振荡速度高度敏感。在50 mL TS中，20至140 rpm的低速条件下细胞生长显著受抑制，接种后迅速死亡；而在170 rpm时恢复正常生长，第6天达到峰值VCD为9.25±0.09×10⁶ cells/mL，在200 rpm和230 rpm时也呈现类似的生长趋势，260 rpm时峰值VCD略有下降至6.66±0.77×10⁶ cells/mL，表明TS的最佳振荡速度范围为170–230 rpm。相比之下，125 mL EF在80 rpm时即可恢复良好生长，峰值VCD达9.00±0.01×10⁶ cells/mL，并且从80 rpm到260 rpm的广泛范围内均能维持稳定的细胞生长，这一现象在500 mL和1 L EF中也一致出现。从抗体生产来看，TS在170 rpm时获得最高效价192 mg/L，200、230和260 rpm时分别降至185、154和136 mg/L；而EF系列在80至200 rpm范围内均获得较高的峰值效价（约173.5–190.5 mg/L），在230和260 rpm时略有下降。代谢物分析显示，在支持细胞生长的振荡速度下，葡萄糖消耗迅速，乳酸积累较少并在培养后期被消耗，氨浓度相对较低，表明代谢效率较高；而在低速条件下，氨积累显著增加，提示混合不充分和氧供应不足导致代谢紊乱。CFD分析进一步揭示了这些生物学结果背后的物理机制。EDR随振荡速度和摇瓶尺寸增大而升高，在TS支持生长的最低速度170 rpm时EDR为0.016 W/kg，而在140 rpm时为0.004 W/kg；在EF支持生长的最低速度80 rpm时，125 mL、500 mL和1 L EF的EDR分别为0.001、0.003和0.007 W/kg。流速方面，TS在170 rpm时的平均流速为0.066 m/s，而125 mL EF在80 rpm时为0.041 m/s，表明适当的流体速度对混合至关重要。湍流动能和剪切应力也随振荡速度升高而增加，但TS的剪切应力始终低于EF，不同尺寸EF之间的剪切应力水平相似。kLa分析显示，TS在170 rpm时kLa高达114.1 h⁻¹，而EF在80 rpm时kLa仅为42.9、35.1和35.3 h⁻¹，说明窄高的TS需要更高的kLa才能满足细胞氧需求，这与其较小的液–气界面面积有关。混合时间的模拟结果表明，TS在170 rpm时95%混合时间仅为4.9 s，而在140 rpm时为31.6 s；EF在80 rpm时混合时间为36.3、36.5和22.8 s，显著低于50 rpm时的270 s左右。表面积与体积比（S/V）数据显示，EF在80 rpm时的S/V值分别为70.5、43.4和35.6，TS在170 rpm时为98.1，表明宽浅的EF依靠较大的界面面积在较低转速下即可实现有效氧传递。KLS分析表明，尽管在较高转速下KLS降至10 µm以下，但细胞生长未受显著影响，这可能是由于培养基中添加的PF-68减轻了剪切应力。CFD的分数分布和空间分布分析显示，提高振荡速度会整体增加高EDR、高速度和高剪切应力区域，尤其在大体积EF中这些区域扩展更明显，提示大规模摇瓶在高转速下可能增加细胞的物理应力。
综合以上结果，研究得出结论：摇瓶培养的流体动力学环境由几何形状、尺寸和操作参数共同决定，优化搅拌条件需要根据具体摇瓶类型进行调整。窄高的TS需要较高的振荡速度（170–230 rpm）以克服混合和氧传递限制，而宽浅的EF在低至80 rpm时即可达到理想的细胞生长和抗体生产，且在80至260 rpm的宽范围内均能维持良好的培养性能。CFD模拟成功量化了各条件下的EDR、剪切应力和kLa等关键参数，解释了实验观察到的细胞生长和代谢差异，并揭示了液–气界面面积和混合时间在决定最低有效搅拌速度中的关键作用。该研究的科学价值在于建立了摇瓶培养物理环境与生物性能之间的机械论联系，为理性优化小规模培养条件提供了定量依据。应用价值体现在所积累的CFD和培养性能数据可作为数据库用于构建预测模型，减少对经验性试错的依赖，并为生物过程数字孪生的开发提供了连接物理与生物组分的基础。研究的亮点包括：系统比较了不同几何形状（TS与EF）和不同尺寸（50 mL至1 L）的摇瓶在广泛振荡速度范围内的培养表现与流体动力学特征；通过CFD与湿实验的紧密结合，揭示了kLa和混合时间是决定细胞能否正常生长的关键参数；发现即使在EDR和剪切应力显著升高的高转速条件下，CHO细胞在含PF-68的培养基中仍能维持正常生长，而抗体生产则对高转速更为敏感。此外，作者还指出了CFD模型的局限性，例如模拟中使用了恒定流体性质，未考虑培养过程中粘度、密度和组成的变化，并建议未来通过整合动态培养基性质参数来提高模型准确性。