学术研究报告：基于Tada8e的高效腺嘌呤碱基编辑器开发及其在小麦二硝基苯胺抗性种质创制中的应用

一、研究团队与发表信息
本研究由山东师范大学生命科学学院的Huanan Han、Ziwen Wu、Ling Zheng等与山东省农业科学院作物研究所的Jihu Li、Shujuan Zhang等合作完成，通讯作者为Changle Ma和Pingping Wang。研究成果发表于The Crop Journal期刊（2022年，第10卷，368-374页），标题为《Generation of a high-efficiency adenine base editor with Tada8e for developing wheat dinitroaniline-resistant germplasm》。

二、学术背景与研究目标
科学领域：本研究属于作物遗传改良与基因编辑领域，聚焦于CRISPR-Cas9衍生的碱基编辑技术（Base Editing）在六倍体小麦中的应用。
研究背景：二硝基苯胺类除草剂（dinitroaniline）因其高效低毒被广泛使用，但小麦对其敏感性强，限制了田间应用。已有研究发现，禾本科杂草（如鹅观草）中微管蛋白基因（tubulin）的Met268-Thr突变可赋予抗性，但传统育种难以在多倍体小麦中快速实现多等位基因同步编辑。
研究目标：开发一种高效腺嘌呤碱基编辑器（ABE），通过靶向编辑小麦微管蛋白基因创制抗性种质，并验证其应用潜力。

三、研究流程与方法
1. WHIEABE编辑器构建
- 设计优化：基于新型腺苷脱氨酶Tada8e（较传统Tada7.10活性更高）与Cas9n(D10A)融合，进行小麦密码子优化，并添加双核定位信号（BpNLS和NpNLS）。
- 载体组装：通过Golden Gate法和In-Fusion克隆技术，将编辑器与报告基因（GFP-mCherry）或筛选标记（Bar抗性基因）整合至载体。

1. 编辑效率验证

   • 原生质体系统：以小麦品种YM20为材料，通过流式细胞术检测GFP-mCherry报告系统的编辑效率（A-to-G转化率）。结果显示，WHIEABE8e（Tada8e版本）编辑效率达24.5%，显著高于WHIEABE7.1（3%）。
     
   • 内源基因测试：靶向编辑小麦内源基因（TaGW2、TaDEP1等），通过Hi-TOM高通量测序验证编辑窗口（A4-A10）和突变比例，WHIEABE8e效率提升3-4倍。
     

2. 抗性位点筛选与植株编辑

   • 靶点鉴定：比对水稻OsTuba2基因，鉴定小麦6个同源微管蛋白基因（1A/1B/1D/4A/4B/4D染色体），设计sgRNA靶向保守Met位点（需A7→G7编辑）。
     
   • 遗传转化：通过农杆菌介导法转化小麦品种Fielder，获得T0代植株。Sanger测序和深度扩增子测序显示，WHIEABE8e在5个完美匹配位点（4B因单碱基错配编辑率低）的编辑效率显著高于WHIEABE7.1，且脱靶效应低。
     

3. 抗性表型验证

   • 除草剂处理：用2.5 mg/L pendimethalin和5 mg/L trifluralin处理T1代种子，发现编辑植株（含1-10个突变等位基因）的萌发率、根长及成株存活率显著高于野生型。
     
   • 剂量效应：五重突变体（5个等位基因编辑）抗性最强，表明微管蛋白突变数量与抗性正相关。
     

四、主要研究结果
1. 编辑器性能提升：WHIEABE8e在小麦中的编辑效率较传统版本提高4-8倍，且脱靶率低于1%（通过Hi-TOM验证）。
2. 抗性机制解析：微管蛋白Met→Thr突变通过干扰除草剂与微管结合位点发挥作用，且多等位基因编辑产生叠加效应。
3. 应用潜力验证：编辑植株在除草剂处理后保持正常农艺性状（株高、穗粒数等），未出现显著产量损失。

五、研究结论与价值
1. 科学价值：首次将Tada8e应用于小麦，为多倍体作物高效编辑提供新工具；揭示了微管蛋白编辑的剂量效应。
2. 应用价值：创制的抗性种质可直接用于小麦田间除草管理，减少化学除草剂对环境的残留危害。

六、研究亮点
1. 技术创新：开发了首个小麦优化的高效ABE（WHIEABE8e），结合密码子优化与核定位增强策略。
2. 跨物种验证：将禾本科杂草的抗性机制成功迁移至小麦，拓展了基因编辑的跨物种应用场景。
3. 多等位基因编辑：首次在小麦中实现五重等位基因同步编辑，为多倍体作物育种提供范式。

七、其他价值
本研究建立的Hi-TOM分析流程可精准量化多等位基因编辑比例，适用于复杂基因组作物的编辑评估。