本研究由芬兰坦佩雷大学（Tampere University）的 Lotta Isosaari、Hanna Vuorenpää、Susanna Miettinen 及 Susanna Narkilahti 等人完成，发表于 Cell Communication and Signaling 期刊，2023 年在线发表，文章编号 21:132。
神经元网络与血管网络是维持人体大多数组织正常功能与稳态的两大关键系统。神经元网络通过接收和传递信息来调控机体功能，而血管网络则为组织提供氧气、营养物质和信号分子。越来越多的证据表明，这两大网络系统之间存在密切的交互作用（neurovascular interactions），这种交互对于组织发育、修复过程以及成年期的稳态维持至关重要。例如，在成年大脑中，神经元距离最近的血管通常不超过 15 微米，以满足其代谢需求；反过来，神经元也能调控血管张力。神经系统与血管系统在发育过程中共享多种导向分子，如 semaphorins、ephrins、vascular endothelial growth factor（VEGF，血管内皮生长因子）和 endothelin 等，表明二者的模式化过程具有协同性。
然而，由于缺乏合适的体外模型，学界对神经元网络与血管网络之间复杂的细胞和分子互作机制仍了解甚少。现有的体外神经血管模型大多为短期培养（≤7 天），且常缺乏支持性的血管壁细胞（mural cells，壁细胞），难以真实再现体内微环境。器官芯片（organ-on-chip，OOC）技术为构建多细胞类型、三维、动态的组织模型提供了可能，但如何在芯片上同时诱导形成功能性的神经元网络和血管网络，并实现长期共培养，一直是个挑战。
基于此，本研究旨在利用人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）来源的神经元、荧光标记的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），以及人骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived stem/stromal cell，BMSC）或脂肪干细胞（adipose tissue-derived stem/stromal cell，ASC）作为壁细胞，在微流控芯片上构建一种新型的三维神经血管网络模型，并探究神经元网络与血管网络形成之间的动态互作关系。
本研究的实验流程主要分为以下几个步骤。
细胞培养与分化。 研究使用了名为 UTA.04511.WTS 的 hiPSC 系，该细胞系来自坦佩雷大学，经供者知情同意，并通过坦佩雷大学医院伦理委员会批准（R20159）。hiPSC 在无饲养层条件下分化为皮层神经元，分化过程包括神经诱导、前体扩增和成熟三个阶段。实验使用分化第 32 天或第 46 天的神经元。HUVEC 为混合供者来源，分别表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），在 EGM-2 培养基中培养，添加 2% 人血清而非胎牛血清，使用第 4 至第 6 代细胞。ASC 来自两名供者的皮下脂肪组织，BMSC 来自两名供者的骨髓样本，均经伦理批准获得。两种间充质干细胞均通过表面标志物分析和成脂、成骨分化能力评估确认其间充质来源。
芯片上三维神经血管网络构建。 研究者将细胞包埋于由 1 mg/ml 大鼠尾胶原 I、1.5 mg/ml 人纤维蛋白原和 0.6 IU/ml 凝血酶组成的凝胶混合物中，注入商用微流控芯片（DAX1，AIM Biotech）的水凝胶通道。HUVEC 的接种密度为 5.0×10⁶ 细胞/ml，神经元为 2.5×10⁶ 细胞/ml，BMSC 或 ASC 为 1.0×10⁶ 细胞/ml。凝胶在 37°C 下聚合 30 分钟后加入培养基。为寻找最适培养条件，研究测试了三种培养基：神经成熟培养基（NMM）、血管生成培养基 EGM-2，以及 NMM:EGM-2 各半的混合培养基。初步实验发现神经元会使纤维蛋白凝胶收缩和降解，因此在所有培养基中均添加了 40 µg/ml 的抑肽酶（aprotinin）以抑制纤维蛋白降解。芯片利用重力驱动的灌流系统，在两侧培养基通道之间形成间质流动，每天更换培养基并保持流动方向一致。不含神经元的共培养（HUVEC+壁细胞）和仅含神经元的单培养作为对照。
免疫染色与成像。 培养至第 10 或 14 天后，样品经 4% 多聚甲醛固定、Triton X-100 通透、驴血清封闭后，进行免疫染色。一抗包括 β-tubulin III（βTubIII）、MAP-2（microtubule-associated protein 2，微管相关蛋白 2）、CD31 和 α-SMA（alpha smooth muscle actin，α-平滑肌肌动蛋白）。二抗为 Alexa Fluor 标记抗体，细胞核用 DAPI 染色。样品在 4°C 下孵育数天，随后用 LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜和 DMI8 倒置荧光显微镜成像。图像用 Fiji、Huygens Essentials 和 Imaris 软件处理。
钙成像。 为评估神经元功能，研究者将分化第 32 天的神经元在六孔板中预成熟 14 天，然后于第 46 天种入芯片。钙成像使用 Fluo-8-AM 或 Fluo-4-AM 荧光染料，加载 1 小时后，用荧光显微镜记录 2–5 分钟的时间序列图像。钙振荡通过 Fiji 软件分析胞体区域的平均荧光强度变化来量化。
灌流与水凝胶完整性检测。 在培养第 8 天，将 2 µm 荧光微球引入芯片的培养基通道，利用重力灌流使微球流经水凝胶。通过 EVOS FL 细胞成像系统每隔 10 秒采集图像，持续 2 分钟，以评估血管结构的灌流能力和水凝胶的完整性。
蛋白分泌分析。 利用人血管生成相关蛋白抗体芯片（Proteome Profiler，R&D Systems）对培养第 13–14 天收集的培养基进行分析，检测 55 种血管生成相关蛋白的相对水平。膜图像用 ChemiDoc 系统采集，斑点像素密度用 HLImage++ QuickSpots 软件定量。
血管图像与统计分析。 血管面积和总长度用 AngioTool 软件分析。组间差异采用非参数 Mann-Whitney U 检验，p<0.05 视为有统计学意义。
培养基优化。 在 EGM-2 培养基中，无论使用 BMSC 还是 ASC，多培养中的血管形成均最成功，CD31 染色证实了血管结构的形成。NMM 培养基中几乎无血管形成，混合培养基中的血管形成优于 NMM 但不如 EGM-2。神经元形态在三种培养基中均较为相似，受培养基影响较小。BMSC 和 ASC 在 EGM-2 中显示出最强的周细胞特性（α-SMA 染色阳性并与血管紧密贴合），而在 NMM 和混合培养基中，α-SMA 阳性细胞未能紧贴血管。灌流实验表明，EGM-2 中的三维样品基本保持完整，并形成了可灌流的血管结构。因此，EGM-2 被选为后续实验的培养基。
神经元在三维神经血管网络中获得功能。 钙成像结果显示，在含 BMSC 或 ASC 的多培养中，神经元均表现出钙振荡，提示神经元具有功能活性。此外，在 NMM 培养的三维神经元单培养中，无论是否经过预成熟，也检测到功能性神经元。但值得注意的是，在 EGM-2 中培养的神经元单培养未检测到钙振荡，且神经元出现向培养基通道异常生长并在水凝胶中聚集的现象。这表明，仅靠 EGM-2 不足以支持神经元的功能成熟，多培养中的内皮细胞和壁细胞对神经元功能成熟有支持作用。
三维神经血管网络的长期稳定培养。 免疫染色显示，hiPSC 来源的皮层神经元、HUVEC 与 BMSC 或 ASC 在胶原-纤维蛋白水凝胶中共同培养至少 14 天后，形成了整合的三维神经元和血管网络。血管网络在水凝胶的整个区域均一分布，壁细胞沿血管排列并扩散至水凝胶各处。神经元网络同样均匀地分布于血管结构之间。高倍图像和共聚焦成像显示，神经元通过突起与血管结构和壁细胞形成细胞连接。该模型具有高度可重复性，使用 BMSC 的实验成功重复 7 次，使用 ASC 的重复 5 次。
神经元网络促进血管生成。 通过比较多培养（神经元+内皮细胞+壁细胞）与共培养（内皮细胞+壁细胞），研究者发现多培养中的血管总面积和总长度在培养后期均高于共培养，尤其在 BMSC 组中更为明显。血管生成相关蛋白芯片分析显示，在检测到的 39 种蛋白中，BMSC 多培养有 38 种、ASC 多培养有 37 种蛋白的表达水平高于相应的共培养。这些蛋白涉及血管成熟、生长因子、基质重塑、炎症及凝血过程。例如，angiogenin、VEGF 和 IL-8 的水平在两类多培养中均显著升高。总体而言，BMSC 多培养中多种蛋白的相对表达水平高于 ASC 多培养。这些结果说明，神经元通过细胞直接接触和分泌血管生成相关因子，显著促进了血管网络的形成。
本研究成功建立了一种基于商用微流控芯片的三维人源神经血管网络模型。该模型能够在长达 14 天的培养期内同时维持形态完整、功能可验证的神经元网络和血管网络。研究发现，添加抑肽酶的血管生成培养基 EGM-2 配合胶原 I–纤维蛋白水凝胶，能够支持神经元、内皮细胞和壁细胞的长期共培养。BMSC 和 ASC 两种壁细胞来源均能支持神经血管网络的形成，其中 BMSC 的表现略优于 ASC。更重要的是，该研究通过蛋白分泌分析证实，神经元在多培养中显著上调了血管生成相关蛋白的分泌，表明神经元在血管生成中起诱导作用。此外，神经元的功能成熟依赖于内皮细胞和壁细胞的存在。
该模型为研究器官发育和疾病状态下的神经血管互作提供了有力工具，并为开发血管化和神经支配的器官芯片以及人体芯片（body-on-chip，BOC）概念奠定了基础。其科学价值在于首次在体外同时实现功能性神经元网络和可灌流血管网络的长期共培养，并系统性地揭示了神经元对血管生成的促进作用。应用价值体现在该平台可用于神经退行性疾病、缺血性脑损伤等与神经血管功能障碍相关疾病的机制研究和药物筛选。
本研究的亮点主要包括：首次在微流控芯片上实现了 hiPSC 来源神经元、HUVEC 和人间充质干细胞的三维长期共培养（≥14 天），并同时获得了功能性的神经元网络和可灌流的血管网络；发现仅凭内皮细胞培养基 EGM-2 不足以支持神经元功能成熟，血管细胞的存在对神经元功能成熟至关重要；通过蛋白分泌谱分析，系统证明了神经元对血管生成的促进作用，且这种作用在 BMSC 多培养中更为突出；此外，研究还解决了纤维蛋白水凝胶在神经培养中快速降解的问题，为后续长期三维神经培养提供了实用方法。