本研究由内蒙古农业大学草地昆虫研究中心段天凤、李玲、王海超和庞保平共同完成，其论文《microRNA miR-2765-3p regulates reproductive diapause by targeting FoxO in Galeruca daurica》发表于学术期刊 Insect Science 2023年第30卷。这项研究聚焦于昆虫学领域，特别是昆虫滞育（diapause）的分子调控机制。昆虫滞育是昆虫为应对不良环境条件而采取的发育停滞的生理现象，对于其生存和种群延续至关重要。其中，生殖滞育（reproductive diapause）主要表现为卵巢发育抑制和脂质大量积累，而保幼激素（juvenile hormone, JH）的缺乏被认为是触发该过程的关键信号。叉头框蛋白O（Forkhead box O, FoxO）作为胰岛素信号通路中一个关键的转录因子，已被证明在调节昆虫滞育中扮演不可或缺的角色。然而，FoxO自身是如何被调控以精确控制滞育进程的，此前尚不清楚。本研究旨在以草原害虫——达乌里萤叶甲（Galeruca daurica）为模型，探究microRNA（miRNA）是否以及如何通过对FoxO的转录后调控来参与生殖滞育的调节，从而揭示滞育调控网络中新的分子机制。

研究背景和目的方面，论文指出，虽然已有大量研究阐明了FoxO的转录激活及其对下游靶基因的调控作用，但在昆虫中，关于FoxO在转录后水平受miRNA调控的知识知之甚少。miRNA是一类重要的转录后调控因子，参与昆虫的生长发育和繁殖等过程，也可能在滞育调控中发挥作用。在前期研究中，该团队已在达乌里萤叶甲成虫中鉴定出多个在不同滞育阶段差异表达的miRNA，其中miR-2765-3p在成虫进入滞育后表达量显著下调超过32倍。与此同时，前期研究也证实保幼激素信号通路在调控达乌里萤叶甲生殖滞育中起着关键作用。因此，本研究的具体目标是验证miR-2765-3p是否通过靶向FoxO来调控达乌里萤叶甲的生殖滞育，并探究保幼激素是否通过调控该miRNA-FoxO轴来发挥作用。

研究流程详述如下： 第一，预测与验证miR-2765-3p与FoxO的靶向关系。 首先，研究人员通过RACE技术获取了达乌里萤叶甲FoxO基因的完整3‘非翻译区（3’ untranslated region， 3‘UTR）序列。随后，联合使用miRanda、TargetScan和RNAhybrid三种生物信息学软件预测可能靶向FoxO的miRNA，发现miR-2765-3p在FoxO的3’UTR上存在潜在的结合位点。为确认两者的表达相关性，通过qRT-PCR技术检测了雌性成虫羽化后1至100天不同发育阶段（包括滞育前、滞育期和滞育终止后）体内miR-2765-3p和FoxO的表达谱。结果显示，两者表达模式呈现近乎相反的动态变化，提示可能存在调控关系。为直接验证靶向作用，研究进行了双荧光素酶报告基因实验。将包含FoxO野生型3‘UTR或种子序列突变型3’UTR的序列克隆至pmirGLO报告载体中，分别与miR-2765-3p模拟物（mimics）共转染至HEK293T细胞中。结果表明，与转染阴性对照相比，共转染miR-2765-3p模拟物和野生型FoxO 3‘UTR的报告载体，其荧光素酶活性显著下降了约46.33%；而当FoxO 3’UTR上的结合位点发生突变时，这种抑制作用被显著阻断。这直接证明了miR-2765-3p能够特异性结合FoxO的3‘UTR并抑制其表达。

第二，体内验证miR-2765-3p对FoxO表达的调控。 在滞育前的雌性成虫中，通过显微注射miR-2765-3p的激动剂（agomir）或拮抗剂（antagomir）来人为过表达或抑制该miRNA。qRT-PCR结果显示，注射agomir后，miR-2765-3p表达显著上调，而FoxO的转录水平则显著下调；相反，注射antagomir后，miR-2765-3p表达被抑制，FoxO的转录水平则显著上调。这证实了在活体昆虫中，miR-2765-3p同样能够负调控FoxO的表达。

第三，探究miR-2765-3p对生殖滞育表型的影响。 在滞育前雌虫中进行功能获得和功能缺失实验。注射miR-2765-3p agomir后，成虫进入滞育的时间延迟了约2.07天。分子水平上，agomir处理促进了卵巢发育相关基因（卵黄蛋白原受体VgR， 卵黄蛋白原Vg1和Vg2）和脂肪降解相关基因（三酰甘油脂肪酶1， TGL1）的表达，但抑制了脂肪合成相关基因（脂肪酸合酶FAS和转酮醇酶2， TKT2）的表达。解剖学观察显示，卵巢发育得到促进，脂肪体发育被抑制。同时，总脂质含量显著降低。这些表型均指向滞育被抑制。相反，注射miR-2765-3p antagomir则导致成虫提前约1.87天进入滞育，分子和表型变化与agomir处理完全相反：卵巢发育相关基因和TGL1下调，脂肪合成基因上调，卵巢发育受阻、脂肪体肥大、脂质积累增加。值得注意的是，在已进入滞育的雌虫中过表达miR-2765-3p，虽能下调FoxO，但并未显著影响滞育状态及相关基因表达，这可能与达乌里萤叶甲的滞育属于专性滞育，需要较长时间才能自然解除的特性有关。

第四，探究FoxO在生殖滞育中的功能。 为确认miR-2765-3p是通过调控FoxO来影响滞育，研究使用RNA干扰技术（RNAi）在滞育前雌虫中敲低FoxO。注射双链RNA（dsFoxO）48小时后，FoxO表达量被敲低超过80%。敲低FoxO产生了与过表达miR-2765-3p极为相似的表型：VgR、Vg1、Vg2和TGL1表达上调，FAS和TKT2表达下调；进入滞育的时间延迟；卵巢发育得到促进，脂肪体发育被抑制，脂质积累减少。这直接证明了FoxO是调控生殖滞育的关键因子，且其功能被抑制的表型与miR-2765-3p过表达的表型一致，支持了miR-2765-3p通过靶向抑制FoxO来发挥功能的逻辑链。

第五，探究激素对miR-2765-3p/FoxO轴的调控。 为了将上游激素信号与发现的miRNA-靶基因轴联系起来，研究向滞育前雌虫注射保幼激素激动剂甲氧普林（methoprene）或蜕皮激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone， 20E）。结果显示，甲氧普林处理能显著上调miR-2765-3p的表达，并同时下调FoxO的表达。而20E处理虽然也能下调FoxO的表达，但对miR-2765-3p的表达没有显著影响，提示20E可能通过其他途径调控FoxO。这一发现将保幼激素信号与miR-2765-3p的上游调控联系起来。

第六，进行激素拯救实验。 为最终证实“保幼激素-miR-2765-3p-FoxO”这条调控轴的存在，研究设计了拯救实验。先向滞育前雌虫注射miR-2765-3p antagomir以抑制其功能，24小时后再注射甲氧普林。结果发现，甲氧普林处理部分拯救了因miR-2765-3p被抑制而导致的卵巢发育缺陷和提前进入滞育的表型。在分子水平上，甲氧普林挽救了因antagomir导致的FoxO上调以及VgR、Vg1、Vg2的下调。这强有力地证明了保幼激素可以通过上调miR-2765-3p来抑制FoxO，从而调控卵巢发育和滞育进程。

本研究的结论是：在达乌里萤叶甲中，保幼激素通过上调miR-2765-3p的表达，进而抑制其靶基因FoxO的转录，最终促进卵巢发育、减少脂质积累，从而抑制生殖滞育的发生。即“JH/miR-2765-3p/FoxO”调控轴在生殖滞育的分子调控网络中扮演着至关重要的角色。

这项研究的科学价值在于，首次在昆虫中实验证实了miR-2765-3p通过靶向FoxO来调控生殖滞育，揭示了一种新的转录后调控机制，丰富了人们对昆虫滞育复杂调控网络的理解。它将上游的激素信号（JH）、中游的miRNA调控和下游的关键转录因子（FoxO）及其控制的生理代谢通路（脂代谢和卵子发生）串联成一个清晰的调控轴线，为阐明滞育的分子机制提供了重要模型和见解。在应用价值上，达乌里萤叶甲是中国内蒙古草原的新害虫，对其滞育调控机制的深入了解，可能为未来开发基于干扰其滞育进程的新型绿色防控策略提供潜在靶点。

本研究的亮点在于：首先，研究具有明确的创新性，首次揭示了miR-2765-3p在昆虫滞育中的功能及其靶基因；其次，研究设计严谨、逻辑完整，从生物信息学预测、体外报告基因验证、体内功能获得与缺失实验、靶基因功能验证到上游激素调控和最终拯救实验，形成了一个完整的证据链，结论可靠；最后，成功地将miRNA调控机制整合到已知的激素信号通路中，构建了一个层次清晰的调控模型，对于理解昆虫生理状态的转换具有普遍意义。此外，研究也指出了一些有待深入探索的问题，例如20-羟基蜕皮酮通过何种途径调控FoxO，以及在专性滞育的维持阶段该调控轴为何失效，这为后续研究指明了方向。