拟南芥B-box结构域蛋白BBX14/15/16与HY5和PIFs形成反馈回路调控下胚轴伸长
本研究由Zeeshan Nasim、Nouroz Karim、Hendry Susila及通讯作者Ji Hoon Ahn完成。Zeeshan Nasim与Nouroz Karim为共同第一作者。主要研究机构为韩国高丽大学（Korea University）生命科学系以及澳大利亚国立大学（The Australian National University）加速未来作物发展ARC培训中心。该研究发表于《Current Plant Biology》期刊第40卷，于2024年10月23日在线发表。
一、 学术背景 本研究的科学领域为植物分子生物学，具体聚焦于植物光形态建成（Photomorphogenesis）的调控机制。光调控的发育过程，如光形态建成和开花，在植物从幼苗出土到繁殖的整个生命周期中扮演着关键角色。在黑暗中，拟南芥幼苗进行暗形态建成（Skotomorphogenesis），形成长长的下胚轴以推动幼苗破土而出；而光照则会诱导光形态建成，表现为下胚轴伸长受抑制、子叶展开并变绿。这一过程受到一系列正负调控因子的精密调控。
其中，光形态建成的关键正调控因子是长下胚轴5（Elongated Hypocotyl 5, HY5），它是一个能直接结合大量靶基因启动子的bZIP类转录因子。而其拮抗因子——光敏色素相互作用因子（Phytochrome-Interacting Factors, PIFs）作为bHLH转录因子，则是暗形态建成的核心负调控因子，主要在黑暗条件下抑制光形态建成相关基因的表达。此外，植物激素如生长素（Auxin）和油菜素内酯（Brassinosteroid, BR）的信号通路也深刻影响着下胚轴的伸长，二者常协同作用，其下游靶基因如小分子生长素上调RNA（Small Auxin Upregulated RNA, SAUR）基因家族和BR响应基因TCH4等已被证明参与细胞伸长过程。
B-box结构域蛋白（BBX）家族成员是整合内部信号与环境 cues 进入发育程序的重要因子。拟南芥BBX家族第III分支的成员BBX14、BBX15和BBX16（文中合称为BBX14/15/16）已被证明在调控开花时间方面功能冗余，且位于GOLDEN2-LIKE（GLK）转录因子的下游。近期研究暗示BBX14和BBX16可能也参与光形态建成调控，然而其具体分子机制，特别是它们与HY5、PIFs等核心调控因子如何互作、是否存在反馈调控、以及其下游靶基因是什么，均不明确。
因此，本研究旨在探究BBX14/15/16在拟南芥下胚轴伸长调控中的具体功能与分子机制。主要目标包括：1) 验证BBX14/15/16在下胚轴伸长中的冗余功能；2) 阐明光照、HY5及PIFs对BBX14/15/16表达的调控关系；3) 探究BBX14/15/16是否与HY5、PIFs构成反馈调控回路；4) 鉴定BBX14/15/16调控的下游靶基因，揭示其通过何种途径影响下胚轴伸长。
二、 详细研究流程 本研究采用了遗传学、分子生物学、生物信息学及生物化学等多种技术手段，流程系统且层层递进。
第一部分：表型分析与基因表达模式确认 研究首先利用一系列遗传材料进行表型分析，包括单个BBX基因的过表达株系（35S:BBX14/15/16）、单个敲低（amir-BBX14）或敲除（BBX15-cr， BBX16-cr）株系，以及三个基因同时敲低的株系（amir-BBX14/15/16）。在长日照（LD）和持续黑暗（DD）条件下，测量了大量幼苗（每个基因型至少14株，3个生物学重复）的下胚轴长度，并通过ImageJ软件进行量化统计分析。同时，通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）和BBX启动子驱动的GUS报告基因染色，检测了BBX14/15/16在光照与黑暗条件下的表达变化。此外，研究还深入挖掘了多个已公开的转录组测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（如SRP072300、PRJCA016521），在组织特异性（下胚轴与子叶）和单细胞水平上精确解析了BBX14/15/16的表达模式。
第二部分：上游调控机制解析 为了探究PIFs和HY5如何调控BBX14/15/16，研究进行了以下工作： 1. 遗传与表达分析：在pif四重突变体（pifq）和hy5单突变体中，通过RT-qPCR检测BBX14/15/16的mRNA水平。并利用公共RNA-seq数据集（GSE164122， SRP299921）进行验证。 2. 信号通路探究：使用 retrograde 信号抑制剂诺氟草酮（Norflurazon, NF）和林可霉素（Lincomycin, LIN）处理幼苗，通过下胚轴表型和BBX基因表达分析，评估经典的PIFs→GLKs→BBXs通路的重要性。同时，分析这些抑制剂处理下pifq突变体的表型与基因表达，以寻找GLK非依赖的调控路径。 3. 直接结合证据挖掘：对已公开的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据（PIF1/3/4/5的数据集，如SRP017774、SRP014179、SRP057594；HY5-GFP的数据集SRP273684）以及DNA亲和纯化测序（DAP-seq）数据（HY5的数据集SRP045296）进行重新分析。利用Galaxy服务器、BWA-MEM比对器、MACS2进行peak calling，并通过IGB基因组浏览器可视化，直接验证PIFs和HY5蛋白在BBX14/15/16基因座上的富集情况。 4. 瞬时转录激活实验：在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中，共浸润含有HY5-GFP效应子载体与野生型或G-box突变型BBX启动子-GUS报告子载体，通过qPCR检测GUS表达，验证HY5对BBX启动子的直接激活作用及G-box基序的必要性。
第三部分：反馈回路与遗传互作验证 1. 反向调控验证：在amir-BBX14/15/16敲低株系中，通过RT-qPCR检测HY5及PIFs（PIF1,3,4,5）的mRNA水平，探究BBX14/15/16是否反向调控这些上游因子。 2. 启动子结合与功能验证：在烟草瞬时实验中，共浸润BBX14/15/16-GFP效应子与野生型或BBX结合位点（T/G-box, E-box）突变型的HY5启动子-GUS报告子，验证BBX蛋白对HY5启动子的直接调控能力。 3. 遗传互作分析：通过杂交构建了双突变体材料，如amir-BBX14/15/16 hy5、amir-BBX14/15/16 pif4、amir-BBX14/15/16 phyb，并系统比较其与单突变体、野生型在下胚轴长度上的差异，以确定这些基因在遗传通路上的上下游关系。
第四部分：下游靶基因鉴定与功能验证 1. 转录组学筛选：重新分析已公开的bbx14突变体RNA-seq数据集（GSE225039），利用Hisat2将reads比对至TAIR10参考基因组，Cufflinks/Cuffdiff进行转录本组装和差异表达基因（DEGs）鉴定。对上调基因进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析。 2. 候选基因验证：从富集到的“响应生长素”和BR相关通路中，挑选出显著上调的SAUR基因（如SAUR1,4,5,7,29,57）和BR响应基因TCH4、EXO，在amir-BBX14/15/16株系中进行RT-qPCR验证。 3. 直接调控机制验证：分析候选靶基因启动子区的潜在BBX结合位点。以SAUR4和TCH4为代表，在烟草瞬时实验中，共浸润BBX14/15/16-GFP效应子与野生型或BBX结合位点突变型的靶基因启动子-GUS报告子，验证BBX蛋白对其启动子的直接抑制效应及结合位点的必要性。 4. 激素敏感性实验：用BR生物合成抑制剂芸苔素唑（Brassinazole, BRZ）处理野生型和amir-BBX14/15/16幼苗，比较其下胚轴长度对抑制剂的敏感性差异，从生理层面验证BBX14/15/16与BR信号通路的关联。
三、 主要研究结果 结果一：BBX14/15/16以冗余方式负调控下胚轴伸长。 过表达任一BBX均导致下胚轴显著变短，而同时敲低三者则导致下胚轴显著变长，单基因敲低/敲除则无明显表型，证明了它们在下胚轴伸长调控中的功能冗余性。光照强烈诱导BBX14/15/16的表达，且这种诱导主要发生在大鼠下胚轴组织中。
结果二：PIFs主要通过GLKs负调控BBX14/15/16表达，但也存在直接调控路径。 pifq突变体中BBX14/15/16表达显著上调，尤其在下胚轴中上调幅度巨大。NF或LIN处理能显著下调BBXs表达并逆转pifq的部分表型，说明经典的PIFs抑制GLKs进而抑制BBXs的路径至关重要。然而，在LIN处理后，pifq中的BBXs表达仍高于野生型，且ChIP-seq数据分析显示PIF1/3/4/5蛋白可直接结合在BBX14/15/16的基因座上游或内部，提示存在一条GLK非依赖的、PIFs直接抑制BBXs的路径。遗传上，敲低BBX14/15/16可以回救pif4突变体的短下胚轴表型，进一步确认了BBXs位于PIFs下游执行功能。
结果三：HY5直接结合并正调控BBX14/15/16表达。 ChIP-seq和DAP-seq数据均显示HY5蛋白直接结合在BBX14/15/16启动子区的G-box基序上。hy5突变体中BBX14/15/16表达显著下调，而过表达HY5则使其上调。烟草瞬时实验证实HY5能激活BBX启动子，且突变G-box后此激活作用几乎完全丧失。遗传互作显示，hy5突变可以抑制amir-BBX14/15/16的长下胚轴表型，表明它们作用于同一遗传通路。
结果四：BBX14/15/16与HY5、PIFs构成反馈调控回路。 在amir-BBX14/15/16植株中，黑暗条件下HY5的转录水平显著降低，而光照条件下PIFs的转录水平显著升高。烟草瞬时实验证明，BBX14/15/16能直接结合HY5启动子区的T/G-box和E-box并激活其表达。同时，PIFs的启动子区也存在潜在的BBX结合位点。这些结果表明，BBX14/15/16不仅能被上游的HY5和PIFs调控，还能反向调控这两个核心因子的表达，从而形成了一个精细的反馈调控网络，以精确调控光信号输出。
结果五：BBX14/15/16通过直接抑制生长素和油菜素内酯响应基因来调控下胚轴伸长。 对bbx14突变体的RNA-seq分析发现，多个SAUR基因和BR响应基因TCH4、EXO显著上调。在amir-BBX14/15/16植株中，SAUR1,4,5,7,29,57和TCH4的表达得到验证性上调。这些基因的启动子区均含有多个T/G-box或E-box。以SAUR4和TCH4为范例的烟草瞬时实验证实，BBX14/15/16能直接抑制它们的启动子活性，且突变这些BBX结合位点后抑制效应消失。此外，amir-BBX14/15/16植株对BR抑制剂BRZ表现出超敏感性，下胚轴抑制程度比野生型更甚，这从生理层面支持了BBX14/15/16负调控BR信号以抑制下胚轴伸长的结论。
四、 研究结论与价值 本研究系统阐明了拟南芥BBX14/15/16蛋白在调控下胚轴伸长中的核心作用及其分子机制。结论如下：BBX14、BBX15和BBX16在功能上冗余，作为下胚轴伸长的负调控因子。它们受到光信号核心组分HY5（直接激活）和PIFs（主要通过抑制GLKs间接抑制，也存在直接抑制）的拮抗调控。更重要的是，BBX14/15/16本身又能通过直接结合启动子，正向调控HY5并负向调控PIFs，从而与这两个核心因子构成了一个复杂的反馈调控回路。在下游，BBX14/15/16通过直接结合并抑制一系列生长素响应SAUR基因和油菜素内酯响应基因（如TCH4）的表达，最终抑制下胚轴的细胞伸长。
本研究的科学价值在于：1) 揭示了BBX家族第III分支成员在光形态建成中的新功能，扩展了我们对BBX蛋白调控网络的认识；2) 发现了PIFs调控BBXs存在GLK依赖和非依赖的双重路径，以及HY5对BBXs的直接调控，丰富了光信号转导网络的层次；3) 首次提出了BBX14/15/16与HY5、PIFs之间形成的反馈调控回路模型，为理解植物如何精细整合光信号以优化生长发育提供了新视角；4) 鉴定出BBX14/15/16直接调控的下游靶基因群，将光信号通路与关键的植物激素（生长素和油菜素内酯）信号通路直接连接起来，阐明了信号整合的关键节点。
五、 研究亮点 1. 功能冗余性的系统证明：通过系列单基因和组合基因遗传材料，清晰证明了BBX14/15/16在下胚轴调控中具有重要的功能冗余性，这与它们在开花调控中的冗余作用一致。 2. 多层次的上游调控机制解析：不仅验证了经典的PIF-GLK-BBX通路，还通过生物信息学分析和遗传实验，揭示了PIFs直接结合并抑制BBXs的GLK非依赖路径，以及HY5直接激活BBXs的机制，描绘了更完整的上游调控图谱。 3. 反馈回路的提出与验证：研究不仅停留在“上游调控下游”的线性关系，通过表达分析和瞬时转录实验，有力证明了BBXs能够反向调控HY5和PIFs的转录，提出了一个动态的反馈回路模型，这是本研究最重要的理论创新点。 4. 下游靶基因的发现与直接调控证据：利用公共数据和高通量方法筛选下游基因，并创新性地通过突变结合位点的瞬时报告实验，为BBXs直接负调控SAUR和TCH4等靶基因提供了强有力的功能证据，将光信号与激素信号通路实质性连接起来。 5. 多技术平台整合：研究娴熟地整合了传统遗传学、分子生物学、生理学实验与深入的生物信息学再分析（包括RNA-seq、scRNA-seq、ChIP-seq、DAP-seq），使结论证据链坚实而全面。
六、 其他有价值的内容 研究还探讨了光敏色素（phyA和phyB）突变对BBX14/15/16表达的影响，发现其表达有轻微下调，但遗传互作显示phyB突变与BBXs敲低在表型上无明显叠加效应，暗示它们可能在同一通路或存在复杂的相互作用。此外，对amir-BBX14/15/16植株中phyA和phyB转录水平的检测显示无扰动，表明反馈调控可能特异性地发生在转录因子层面（HY5/PIFs），而非上游光受体层面。这些细节为进一步研究指明了方向。