这项研究由Sarah R. Jacobs, Catherine E. Herman, Nancie J. MacIver, Jessica A. Wofford, Heather L. Wieman, Jeremy J. Hammen, 以及Jeffrey C. Rathmell共同完成。通讯作者是Jeffrey C. Rathmell，其单位是杜克大学医学中心的药理学与癌症生物学系、免疫学系以及Sarah W. Stedman营养与代谢中心。该研究于2008年发表在《免疫学杂志》（*The Journal of Immunology*）上，具体卷期为第180卷第7期，页码为4476-4486。
学术背景 该研究属于免疫学，特别是免疫代谢领域。T细胞是适应性免疫的核心，其激活（activation）过程伴随着剧烈的细胞生长、增殖和效应功能（如分泌细胞因子），这些都需要巨大的能量和生物合成原料支持。已知T细胞在激活后其葡萄糖代谢会显著增强，但具体调控机制，尤其是共刺激信号（costimulation）如何精确调控葡萄糖摄取（glucose uptake）以支持T细胞功能，尚不完全清楚。研究背景表明，葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）是淋巴细胞主要的葡萄糖转运体（glucose transporter），在静息T细胞中表达量很低，激活后会上调。同时，PI3K/Akt信号通路被认为在调控细胞代谢中起着关键作用。然而，葡萄糖摄取是否确实是T细胞激活过程中的限制性因素，以及CD28共刺激信号如何通过具体分子机制（例如是依赖Akt还是不依赖Akt）来上调葡萄糖摄取，是本研究旨在解决的核心科学问题。因此，本研究的目标是阐明葡萄糖摄取在T细胞激活中的关键作用，并详细解析CD28共刺激信号调控葡萄糖摄取（特别是通过GLUT1）的双重分子机制。
详细研究流程 本研究采用了多层次、互补的研究策略，包括体外细胞功能实验、转基因动物模型、以及信号通路分析，以全面回答上述科学问题。具体流程可以概括为以下几个主要部分：
第一部分：CD28共刺激对T细胞葡萄糖摄取的必要性。 研究首先在体外验证CD28信号对T细胞激活后葡萄糖摄取的影响。研究对象是纯化的小鼠T细胞。流程包括：1. 抗体包板刺激：使用不同浓度的抗CD3抗体（anti-CD3）单独或联合抗CD28抗体（anti-CD28）包被培养板，刺激纯化的T细胞1天。2. 葡萄糖摄取测定：使用放射性标记的2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-[³H]glucose）来定量测定细胞在短时间内摄取葡萄糖的能力。为了模拟更生理性的抗原提呈细胞（APC）环境，研究还建立了 巨噬细胞共培养体系。从骨髓中培养出原代巨噬细胞，用LPS激活后，与T细胞共培养，并加入可溶性抗CD3来激活T细胞受体（TCR）。通过添加CTLA4-Ig（可阻断CD28与其配体的结合）或抗ICAM-1抗体，来分别阻断CD28或ICAM共刺激信号，然后检测T细胞的葡萄糖摄取。
第二部分：葡萄糖可用性对T细胞功能的影响。 为了评估葡萄糖是否确实是T细胞激活的限制性因素，研究设计了 葡萄糖限制实验。将纯化的T细胞置于含有不同浓度葡萄糖（从0到生理水平）的培养基中，用抗CD3和/或抗CD28进行刺激。培养2-3天后，检测多项T细胞功能指标：1. 细胞存活率：通过碘化丙啶（PI）排除法结合流式细胞术分析。2. 细胞因子产生：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的水平。3. 细胞增殖：在刺激前用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记T细胞，通过流式细胞术分析CFSE稀释程度来判断细胞分裂次数。
第三部分：GLUT1过表达在体内的效应。 为了直接验证提高葡萄糖摄取能力是否足以影响T细胞功能，研究利用了 T细胞特异性GLUT1转基因小鼠（GLUT1 TG）。首先，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）和葡萄糖摄取实验，确认了转基因小鼠胸腺细胞和成熟T细胞中GLUT1蛋白水平和基础葡萄糖摄取能力确实升高。接着，系统分析了年轻（6-8周）GLUT1转基因小鼠的T细胞发育（胸腺亚群、脾脏T/B细胞数量）、静息状态表型（CD25, CD44表达）以及体外刺激后的反应（细胞大小、IL-2和IFN-γ产生）。此外，为了评估长期影响，研究还分析了 老年（约1岁）GLUT1转基因小鼠，观察其外周T细胞的激活/记忆表型（CD25, CD44, CD69表达）、体外再刺激的细胞因子产生能力，以及血清免疫球蛋白（Ig）水平和肾脏Ig沉积情况（通过免疫荧光显微镜检查）。
第四部分：解析CD28调控葡萄糖摄取的机制——Akt通路的作用。 研究深入探究了CD28下游信号，特别是PI3K/Akt通路的作用。流程包括：1. 使用Akt1缺陷小鼠：分离Akt1⁻/⁻和野生型对照小鼠的T细胞，在体外刺激后比较其葡萄糖摄取能力。2. 使用组成型活性Akt转基因小鼠（myristoylated Akt, Makt TG）：该小鼠T细胞中持续表达膜定位的活性Akt。通过Western Blot验证刺激后Akt磷酸化水平，并检测这些转基因T细胞在静息和不同刺激条件下的葡萄糖摄取、GLUT1蛋白水平及糖基化状态。3. PI3K抑制剂处理：在T细胞刺激过程中加入PI3K抑制剂LY294002，观察对GLUT1蛋白糖基化迁移率的影响。4. GLUT1膜定位分析：为了直接观察CD28对GLUT1膜运输的调控，研究采用了 骨髓重建实验 这一特殊方法。具体流程是：用表达Myc标签GLUT1（Myc-GLUT1）的逆转录病毒转导造血干细胞（HSC），然后将这些细胞移植到经致死性辐照的Rag1⁻/⁻小鼠体内，重建免疫系统。2个月后，从这些嵌合小鼠体内分离T细胞，用不同条件刺激，然后通过流式细胞术使用抗Myc抗体检测细胞表面GLUT1的水平，同时通过Western Blot检测总Myc-GLUT1蛋白量。
第五部分：GLUT1与Akt的协同效应。 为了验证“CD28通过独立通路分别上调GLUT1蛋白（不依赖Akt）和促进GLUT1膜运输/活性（依赖Akt）”的假说，研究 培育了GLUT1和Makt双转基因小鼠（GLUT1/Makt DTG）。系统地比较了非转基因、GLUT1单转基因、Makt单转基因以及双转基因小鼠的T细胞在以下方面的差异：1. 基础葡萄糖摄取和细胞大小。2. 静息状态激活表型（CD25, CD44, CD69）。3. 体外刺激后的增殖能力（CFSE稀释实验），特别是在有无CD28共刺激的条件下。
主要结果 1. CD28共刺激是T细胞激活后葡萄糖摄取大幅增加所必需的。 体外抗体刺激实验表明，仅抗CD3刺激只能小幅增加葡萄糖摄取，而联合抗CD28刺激则能引起强烈的、剂量依赖性的葡萄糖摄取增加。在巨噬细胞共培养体系中，阻断CD28信号（使用CTLA4-Ig）能显著抑制TCR激活诱导的葡萄糖摄取峰值，证实了CD28在生理性激活环境中的必要性。阻断ICAM-1也有类似但可能较弱的效果，表明共刺激信号存在一定冗余。
2. 葡萄糖是T细胞增殖和IFN-γ产生的关键限制因素。 葡萄糖限制实验显示，T细胞存活和IL-2产生仅需极低浓度的葡萄糖即可维持，甚至在无葡萄糖时，若给予强共刺激，细胞仍能存活一段时间并产生IL-2。然而，T细胞增殖和IFN-γ的产生则高度依赖葡萄糖浓度。在低葡萄糖条件下，即使存在CD28共刺激，T细胞的增殖能力和IFN-γ分泌也受到严重抑制。这直接证明了葡萄糖代谢，特别是其摄取速率，是支撑T细胞克隆扩增和特定效应功能（如Th1型反应）的瓶颈。
3. 过表达GLUT1增强T细胞激活并导致老年期免疫异常。 在年轻GLUT1转基因小鼠中，T细胞发育和静息态稳态基本正常，但静息T细胞体积增大，且在体外刺激时，即使CD28信号较弱，也能产生更多的IL-2和IFN-γ，表明其激活阈值降低，葡萄糖摄取是限制因素。最具说服力的结果是老年表型：与同龄对照相比，老年GLUT1转基因小鼠的外周T细胞中具有激活/记忆表型（高CD44, CD69）的细胞比例显著升高，这些细胞在体外再刺激时能产生远超对照的细胞因子。此外，这些小鼠血清中所有Ig亚型水平均升高，肾脏出现Ig沉积，提示存在自身免疫倾向。这些体内结果强有力地证明，长期、不适当地提高葡萄糖摄取能力，足以驱动T细胞过度激活和积累，可能导致年龄相关的免疫病理。
4. CD28通过Akt依赖和非依赖的双重途径调控葡萄糖摄取。 * GLUT1蛋白表达的上调不依赖Akt：在弱TCR刺激下，CD28共刺激能显著增加GLUT1总蛋白水平及其糖基化程度；而在强TCR刺激下，即使没有CD28，GLUT1也能被诱导。重要的是，Makt转基因并不能在弱CD3刺激下增加GLUT1蛋白，说明CD28诱导GLUT1表达是通过独立于Akt的途径（可能是通过增强TCR信号如NFAT/NF-κB，或通过其他CD28特异性接头蛋白如Vav1）。 * GLUT1的膜运输和/或活性调控依赖Akt/PI3K：Akt1缺陷小鼠T细胞的葡萄糖摄取受损。Makt转基因T细胞在静息状态下的基础葡萄糖摄取显著高于对照，但其GLUT1总蛋白量并未增加。PI3K抑制剂处理能改变CD28共刺激诱导的GLUT1糖基化迁移率。最关键的直接证据来自骨髓重建实验：在Myc-GLUT1表达量固定的情况下，CD28共刺激能特异性增加细胞表面Myc-GLUT1的水平，而不改变总蛋白量。这些数据共同表明，Akt/PI3K通路主要调控GLUT1向细胞膜的运输或其内在转运活性。 * Akt的效应依赖于GLUT1蛋白水平：在弱CD3刺激（GLUT1蛋白不增加）下，Makt转基因无法模拟CD28对葡萄糖摄取的提升作用；而在强CD3刺激（GLUT1蛋白被诱导）下，Makt则能显著提升葡萄糖摄取至接近CD28共刺激的水平。这逻辑上连接了前两个发现。
5. GLUT1与Akt协同作用，可替代CD28功能。 双转基因小鼠的实验完美验证了上述模型。GLUT1/Makt双转基因T细胞的葡萄糖摄取表现出 协同性增加（远高于任一单转基因），细胞体积也最大，静息时表现出最强的激活/记忆表型。在体外刺激实验中，双转基因T细胞在仅有抗CD3刺激时，其增殖能力就达到了与野生型细胞在CD3+CD28刺激下相当的水平，即实现了 CD28非依赖性（CD28-independence）的激活。这直接证明，同时提供高水平的GLUT1蛋白（模拟CD28的Akt非依赖功能）和持续的Akt活性（模拟CD28的Akt依赖功能），可以基本替代CD28共刺激在促进葡萄糖代谢和T细胞激活方面的核心作用。
结论与意义 本研究得出核心结论：葡萄糖摄取是T细胞激活过程中的一个关键限制步骤。CD28共刺激通过可分离的（separable）双重机制来解除这一限制，以支持最佳的T细胞反应：一是通过Akt非依赖途径（可能涉及增强TCR信号）上调GLUT1蛋白的表达和修饰；二是通过激活PI3K/Akt通路来促进GLUT1向细胞表面的运输和/或提高其活性。这两条通路的协同作用，对于满足T细胞激活后巨大的代谢需求至关重要。
本研究的科学价值在于，它首次系统、精细地剖析了共刺激信号调控T细胞代谢的分子开关，将CD28的功能具体落实到对葡萄糖转运体GLUT1的“量”（表达）和“质”（定位/活性）的双重调控上，建立了“信号（CD28）→ 效应分子（GLUT1）→ 代谢表型（葡萄糖摄取）→ 细胞功能（增殖、效应）”的清晰逻辑链条。其应用价值在于揭示了免疫代谢检查点的重要性：GLUT1和Akt等代谢调节因子可能成为干预T细胞功能的新靶点。例如，在肿瘤免疫治疗中，增强T细胞的葡萄糖代谢或许能改善其功能；而在自身免疫病中，抑制病理性的T细胞代谢亢进可能成为新的治疗策略。此外，研究也提示营养状态（如葡萄糖水平）可能直接影响机体免疫应答的强度和质量。
研究亮点 1. 重要发现：明确证实葡萄糖摄取是T细胞激活（尤其是增殖和IFN-γ产生）的限制性因素；揭示了CD28调控GLUT1和葡萄糖摄取的双重、可分离的分子机制；首次在体内证明长期过表达GLUT1足以导致T细胞过度激活和年龄相关的自身免疫样表型。 2. 方法新颖性与系统性：研究采用了非常系统且互补的实验体系，从简单的体外刺激到复杂的巨噬细胞共培养，从基因敲除（Akt1⁻/⁻）到多种转基因小鼠模型（GLUT1 TG， Makt TG， DTG），并结合了骨髓重建嵌合体这一巧妙技术来直接观察膜运输。这种多层次验证使得结论非常坚实。 3. 逻辑严谨：研究设计环环相扣。例如，通过比较不同强度TCR刺激下GLUT1的表达和对Akt的需求，自然推导出“Akt效应依赖GLUT1蛋白水平”的结论；最终通过双转基因小鼠实现机制合成与功能验证，完美闭环。
其他有价值内容 研究在讨论部分将T细胞的CD28-GLUT1调控机制与胰岛素调控脂肪/肌肉细胞GLUT4的机制进行了类比，提出了“免疫代谢的胰岛素样调节”这一有趣概念。同时，也指出了高糖代谢可能通过多种途径促进T细胞活化，包括提供生物合成前体、产生NADPH以及通过抑制GSK3β等信号节点来增强生存和激活信号，这为后续研究提供了方向。最后，研究将免疫代谢与肿瘤代谢（Warburg效应）联系起来，暗示了基础代谢调控机制的共通性及其广泛的病理生理意义。