本研究的主要作者包括Francesco Pizzitutti（来自法国原子能委员会）、Andrea Giansanti、Paola Ballario、Prisca Ornaghi、Paola Torreri、Giovanni Ciccotti以及Patrizia Filetici（后六位作者主要来自意大利罗马大学“La Sapienza”、意大利国家研究委员会分子生物学与病理学研究所及意大利高等卫生研究院）。这项研究发表于《Journal of Molecular Recognition》期刊，于2005年9月22日在线发表，并于2006年正式刊出（卷19，第1-9页）。

这项研究属于结构生物学、生物化学与计算生物学交叉领域。其核心科学背景是理解蛋白质与蛋白质、蛋白质与修饰组蛋白之间的识别机制，特别是溴结构域（Bromodomain）的功能。溴结构域是存在于许多染色质相关蛋白和组蛋白乙酰转移酶中的进化保守模块，它能特异性识别组蛋白尾巴上的乙酰化赖氨酸，从而在染色质修饰和基因表达调控中扮演关键角色。研究的直接动机源于一个具体的观察：酵母组蛋白乙酰转移酶Gcn5p的溴结构域中，存在一个高度保守的脯氨酸残基（Pro371）和一个甲硫氨酸残基（Met372）。虽然晶体结构显示Pro371并不直接与乙酰化组蛋白底物相互作用，但前期实验表明，将这两个残基同时突变为苏氨酸和丙氨酸（双突变体，Pro371Thr/Met372Ala）会损害染色质重塑活性。这一矛盾现象引发了研究者的兴趣：为何一个不直接参与结合的残基的突变会导致功能丧失？其背后的分子机制是什么？因此，本研究的目标是综合运用生物学实验和分子动力学（Molecular Dynamics， MD）模拟，深入探究Pro371和Met372在Gcn5p溴结构域功能中的具体作用，特别是它们在结构动力学和分子识别中的角色。

研究采用了多步骤、实验与模拟紧密结合的工作流程。研究涉及的主要研究对象是酵母Gcn5p的溴结构域及其突变体，具体包括：1) 野生型溴结构域（WBR）；2) 溴结构域完全缺失的酵母菌株（ΔBR）；3) 携带Pro371Thr/Met372Ala双突变的酵母菌株和蛋白质（DBR）；以及为深入机制分析而通过模拟构建的4) 单点突变体Pro371Thr（BRP371T）和5) 单点突变体Met372Ala（BRM372A）。

实验流程首先从体内功能验证开始。研究者在氨基酸剥夺条件下（通过添加5-甲基-DL-色氨酸实现）培养了野生型、ΔBR和DBR三种酵母菌株。通过系列稀释点板实验，观察并比较了它们在正常培养基和胁迫培养基上的生长情况，以评估溴结构域及其关键残基对细胞在应激条件下存活的重要性。其次，为了直接定量评估突变对分子结合能力的影响，研究者进行了体外生物物理实验。他们在大肠杆菌中表达并纯化了野生型WBR和双突变体DBR的溴结构域蛋白。利用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance， SPR， 使用Biacore仪器）技术，将两种蛋白分别固定在不同的芯片通道上，然后让未修饰的和在第16位赖氨酸乙酰化的组蛋白H4肽段（残基1-20）作为分析物流过芯片表面。通过实时监测结合信号（传感图），精确测量了两种溴结构域与两种肽段的结合亲和力差异。第三，为了从原子层面解释观察到的表型，研究进行了深入的分子动力学模拟。模拟基于Gcn5p溴结构域与乙酰化组蛋白H4肽段复合物的晶体结构（PDB ID: 1E6I）。他们构建了四个不同的模拟体系：野生型WBR、双突变体DBR、以及两个单点突变体BRP371T和BRM372A。所有模拟均使用ORAC分子动力学程序，采用CHARMM27力场，在显式水溶液和周期性边界条件下进行。模拟过程包括能量最小化、逐步升温、等温等压平衡等标准步骤，最终进行了10纳秒（WBR）或5纳秒（突变体）的生产性模拟运行。数据分析主要围绕三个关键指标：均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation， RMSD， 用于评估整体结构稳定性）、均方根涨落（Root-Mean-Square Fluctuation， RMSF， 用于评估各残基原子的局部柔性）以及平均残基间距离（用于比较突变体与野生型平均结构的差异）。此外，研究者还对多种酵母蛋白的溴结构域序列进行了比对，以分析Pro371和Met372的进化保守性。

研究取得了一系列环环相扣的结果。在体内生长实验中，在氨基酸剥夺条件下，ΔBR菌株和DBR菌株均表现出比各自野生型对照显著降低的生长能力，而DBR的生长缺陷程度介于野生型和完全缺失型之间。这一结果表明，完整的溴结构域对于细胞应对胁迫至关重要，而Pro371和Met372双突变部分模拟了结构域缺失的表型，暗示这两个残基对溴结构域的正常功能不可或缺。体外SPR实验提供了直接的生化证据：双突变体DBR与乙酰化赖氨酸16的H4肽段的结合信号明显弱于野生型WBR，而与未修饰的肽段均无明显结合。这确凿地证明了Pro371和/或Met372的突变直接削弱了溴结构域对其天然配体（乙酰化组蛋白尾巴）的识别能力。

然而，晶体结构显示这两个残基并不直接接触配体，因此功能丧失的机制需要从结构动力学角度寻找答案。分子动力学模拟的结果为此提供了关键洞见。首先，对野生型WBR的模拟显示，溴结构域的整体结构稳定，其四个α螺旋束刚性较强。而连接螺旋Z和A的ZA环则表现出显著更高的柔性（RMSF值更高），这个环像盖子一样覆盖在容纳乙酰化赖氨酸的结合口袋上方。其次，对突变体的模拟揭示了不同突变的不同影响。单点突变Met372Ala（BRM372A）对整体结构稳定性和局部柔性几乎没有影响，其RMSD和RMSF图谱与野生型高度相似。相比之下，单点突变Pro371Thr（BRP371T）则导致了ZA环特定区域（残基Val356-Asp363）的原子涨落显著增加（约40%），但整体结构并未发生重大重构（RMSD与野生型相当，平均结构距离小）。最引人注目的是双突变体DBR的模拟结果：其RMSD值持续增长，在整个5纳秒模拟中未能达到平台期，最终偏离起始结构约3.0 Å，平均结构也与野生型差异巨大（距离达1.15 Å）。同时，其RMSF图谱在整个蛋白质，包括原本刚性的α螺旋区域，都显示出普遍升高的涨落。这表明双突变不仅像Pro371Thr单点突变那样加剧了ZA环的柔性，更严重地破坏了整个溴结构域的结构稳定性。

序列比对分析进一步支持了模拟结论。研究者比较了能结合乙酰化核小体的Gcn5p和Snf2溴结构域，以及不能结合的Spt7溴结构域。发现不能结合的Spt7恰好缺失了对应于Gcn5p中Pro355和Pro371的脯氨酸（位于ZA环的两端），而直接与乙酰赖氨酸相互作用的残基在Spt7中却是保守的。这强烈暗示，Pro371（及其同源物）的存在对于维持ZA环适当的功能性构象或动力学特性至关重要，而非直接参与结合。

综合以上所有结果，本研究得出了明确且深入的结论。Pro371是维持酵母Gcn5p溴结构域功能的关键残基。其作用机制并非通过直接与乙酰化赖氨酸相互作用，而是作为ZA环的一个关键的“动力学锚定点”。Pro371的突变（特别是与Met372的协同突变）会破坏ZA环的固有运动模式，导致其柔性异常增加（BRP371T）甚至引发整个结构域的构象不稳定（DBR）。ZA环的动态特性对于其作为“盖子”正确开合、优化结合口袋以容纳乙酰化赖氨酸至关重要。因此，Pro371的突变通过扰动ZA环的动力学，间接但有效地削弱了溴结构域对乙酰化组蛋白尾巴的识别能力。Met372的作用相对次要，其突变本身影响不大，但与Pro371Thr组合时会产生协同 destabilizing 效应。

本研究的科学价值在于，它超越了静态结构分析，通过巧妙的实验与模拟结合，揭示了蛋白质功能中“结构动力学”决定“分子识别”的一个典型案例。它阐明了高度保守但不直接参与结合的残基如何通过调控局部结构的柔性来影响蛋白质功能，为理解蛋白质-蛋白质相互作用的变构调控和动态识别机制提供了新视角。在应用层面，这项研究指出了通过靶向调控ZA环动力学来设计调控溴结构域功能的小分子药物的潜在可能性，因为许多疾病（如癌症）与溴结构域蛋白的功能失常有关。研究还展示了分子动力学模拟在解释突变体表型和揭示原子级别机制方面的强大能力，是连接基因型、结构动力学与表型的有力桥梁。

本研究的亮点突出。首先，其重要发现是明确了Pro371作为“动力学开关”的非经典功能角色，解决了晶体结构观察与功能缺失表型之间的矛盾。其次，研究方法的创新性在于将经典的体内遗传学表型分析（酵母生长实验）、定量的体外生物物理测量（SPR）与原子分辨率的计算机模拟（MD）三者无缝整合，形成了一个从宏观表型到微观机制的完整证据链。这种多学科交叉的研究策略使得结论非常坚实。最后，研究对象的特殊性在于聚焦于一个高度保守且功能重要但机制不明的单一残基，通过精细的突变设计和多层次分析，揭示了其在蛋白质动态功能中的核心作用，具有很高的范例价值。