本研究由来自韩国海洋研究与发展研究院（Korea Ocean Research & Development Institute）海洋生物技术研究中心的Jung-Hee Woo、Ji-Hyun Kang、Sung Gyun Kang、Young-Ok Hwang及Sang-Jin Kim等人共同完成。该研究成果于2009年发表在学术期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》（应用微生物学与生物技术）上。
一、研究背景与目的
本研究属于工业微生物学与生物催化领域的原创性研究。环氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EHase）是一类能够将环氧化物（epoxide）通过添加水分子水解为相应邻二醇（vicinal diol）的酶。由于手性纯（enantiopure）的环氧化物和邻二醇是制备多种生物活性化合物的通用手性合成中间体，因此在制药工业中，利用具有对映选择性（enantioselectivity）的环氧化物水解酶来生产手性纯环氧化物具有巨大的应用潜力。然而，已知的对映选择性环氧化物水解酶数量有限，这促使研究者们不断探索新的酶资源。传统上从环境中筛选产酶微生物的方法效率有限，而随着基因组测序技术的飞速发展，利用生物信息学手段分析基因组序列，快速克隆和鉴定新的酶基因成为一条有效途径，尽管不同来源的环氧化物水解酶之间的氨基酸序列同源性（identity）往往很低。本研究正是在此背景下，旨在从海洋细菌Novosphingobium aromaticivorans（芳香物新鞘氨醇菌）中，通过基因组序列分析的方法，发现、克隆并鉴定一种新的对映选择性环氧化物水解酶，并系统研究其酶学特性。
二、研究工作流程
本研究的工作流程主要分为四个阶段：
第一阶段：基因的鉴定与序列分析 研究团队首先对N. aromaticivorans的基因组序列（其全基因组序列已由Moore基金会测定）进行了深入分析。他们利用蛋白质查找程序（ProteinFinder）和BLAST程序，通过搜索环氧化物水解酶保守的特征基序（motif），如催化三联体（catalytic triad）模体SM-X-Nu-X-SM-SM和氧阴离子洞（oxyanion hole）的模体H-G-X-P，来筛选候选基因。在筛选到的候选基因中，研究人员手动确认了关键的假定活性位点残基是否存在，包括参与开环作用的酪氨酸（tyrosine）残基、HGXP模体以及SM-X-Nu-X-SM-SM模体。通过这种方法，他们鉴定出一个与Erythrobacter litoralis HTCC2594菌株中的环氧化物水解酶EEH1具有高达67%相似性的开放阅读框（open reading frame，ORF）。有趣的是，与E. litoralis HTCC2594含有多个环氧化物水解酶基因不同，N. aromaticivorans的基因组中似乎只编码这一个环氧化物水解酶基因，该基因被命名为neh。序列分析确认，neh基因全长1134个碱基对（bp），编码一个包含377个氨基酸、分子量约为42.083千道尔顿（kDa）的蛋白质。该蛋白质序列中包含所有对酶功能至关重要的保守残基，例如由天冬氨酸177（Asp177）、谷氨酸328（Glu328）和组氨酸355（His355）组成的催化三联体，以及氧阴离子洞模体（HGW101P）。系统发育分析（phylogenetic analysis）显示，NEH酶属于微粒体环氧化物水解酶（microsomal EHs）群，尽管它缺少大多数微粒体环氧化物水解酶中常见的膜锚定结构（membrane anchor）。为了验证该基因的功能，研究者培养了N. aromaticivorans的全细胞，并证实其对苯乙烯氧化物（styrene oxide，SO）具有对映选择性水解活性，酶活性增长与细胞生长正相关。
第二阶段：基因的克隆、表达与蛋白纯化 在确认基因序列后，研究人员通过聚合酶链式反应（PCR）扩增了neh基因的全长序列，并将其克隆到表达载体pET-24a(+)上。重组质粒被导入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株中进行异源表达。为了便于纯化，他们在蛋白质的C端融合了一个6xHis标签。在37°C下，通过添加1毫摩尔（mM）的IPTG诱导蛋白表达3小时后，收集细胞并通过超声破碎。目标重组酶（recombinant NEH，rNEH）通过一步金属螯合亲和层析法（metal affinity chromatography）进行纯化。SDS-PAGE分析结果显示，纯化后的rNEH表现为分子量约42 kDa的单一条带，纯度达到均一。
第三阶段：酶学特性表征 | 测定内容 | 条件与方法 | 结果 | | :— | :— | | 最适pH和最适温度 | 使用不同缓冲液体系测定不同pH（4.0-10.0）和温度（4°C-70°C）下的酶活。底物为SO。 | 最适pH为6.5，最适温度为45°C。酶在pH 7.5以下较为稳定，pH 8.0以上不稳定。在10°C的低温下仍保留超过40%的活力，表现出冷适应特性。 | | 底物谱和对映选择性 | 使用多种外消旋（racemic）环氧底物（如图）和气相色谱（GC）分析，手性色谱柱定量对映体。 | 酶对苯乙烯氧化物（SO）、缩水甘油苯基醚（glycidyl phenyl ether, GPE）、环氧丁烷（epoxybutane, EB）和环氧氯丙烷（epichlorohydrin, ECH）表现出对映选择性水解，而对环氧己烷（epoxyhexane, EX）的两种对映体水解速率相近。 | | 底物浓度抑制效应 | 使用浓度从17 mM到102 mM的外消旋SO测定。 | 在高达100 mM的底物浓度下，未观察到明显的底物抑制现象。 |
第四阶段：动力学拆分与构型分析 | 测定内容 | 条件与方法 | 结果 | | :— | :— | | 动力学拆分（Kinetic Resolution） | 使用17 mM外消旋SO为底物，在最优条件下反应，定时取样，用气相色谱（GC）和高效液相色谱（HPLC）分析底物和产物。 | 酶优先水解®-苯乙烯氧化物（®-SO）。反应20分钟后，剩余的(S)-苯乙烯氧化物（(S)-SO）对映体过量值（enantiomeric excess, ee）超过99%，产率为11.7%（理论最大产率50%）。计算得出对映体比率（enantiomeric ratio, E）为6.23。 | | 产物构型分析 | 分别以对映纯的®-SO和(S)-SO为底物，用HPLC分析生成的1-苯基-1,2-乙二醇（1-phenyl-1,2-ethanediol, PED）的构型。 | ®-SO被转化为®-PED和(S)-PED，比例为3:1；(S)-SO则专一性地被转化为(S)-PED。表明酶对碳原子的攻击具有区域选择性。 | | 动力学参数测定 | 以不同浓度的®-SO和(S)-SO为底物，测定初始反应速率，利用Sigma Plot软件进行非线性回归拟合米氏方程。 | 对®-SO的Vmax（最大反应速率）为40.00 μmol/min/mg，Km（米氏常数）为6±0.3 mM，催化效率（kcat/Km）为4.63；对(S)-SO的Vmax为18.67 μmol/min/mg，Km为4±0.3 mM，催化效率为3.24。®-SO的水解速率是(S)-SO的两倍，解释了酶的对映选择性。 |
三、主要研究结果与结论
本研究成功地从芳香物新鞘氨醇菌（N. aromaticivorans）中鉴定并克隆了一个对映选择性环氧化物水解酶基因neh。重组酶NEH在纯化后展现出清晰的酶学特性。结果证明，NEH是一种对映选择性环氧化物水解酶，能以动力学拆分的方式高选择性地水解®-SO，从而高效获得高光学纯度（ee > 99%）的(S)-SO。NEH的特性令人关注，首先，它在高达100 mM的外消旋底物浓度下未表现出底物抑制现象，这克服了许多环氧化物水解酶应用时的一大障碍，有利于工业上的高浓度底物转化。其次，该酶具有冷适应特性，在低温下仍保持高活性，这在特定工艺条件下具有应用价值。从机理上看，®-SO的水解速率远高于(S)-SO是酶表现出对映选择性的动力学原因。产物构型分析揭示了该酶复杂的区域选择性，即其对环氧环上不同碳原子的进攻具有偏好性，这与文献中报道的其他环氧化物水解酶一致。
四、研究亮点与价值
本研究的科学价值在于提供了一个成功的范式，即结合基因组序列分析和传统分子生物学技术，能够快速地从海洋微生物中发现和鉴定具有新颖特性的生物催化剂。这再次验证了基因组挖掘（genome-based sequence search）策略的有效性，即使目标蛋白与已知蛋白质的总体序列一致性很低，只要关键的催化功能域保守，就能快速锁定目标基因。同时，测序结果为NEH中存在催化三联体和HGXP模体等保守结构是发挥环氧化物水解酶活性的最低要求这一观点提供了新的证据。在应用价值方面，新发现的NEH酶具有无底物抑制、冷适应性以及对(S)-苯乙烯氧化物的高对映选择性等优点，为制药工业中生产高价值的手性纯环氧化物和邻二醇中间体提供了一个有潜力的新工具。NEH酶对多种单取代环氧化物的选择性差异，也为进一步研究其底物识别与手性分化机制提出了有趣的问题，为后续的酶分子改造指明了方向。