本次发表的研究成果由德国慕尼黑大学、柏林洪堡大学及中国农业大学的植物分子生物学研究团队完成，通讯作者为Tatjana Kleine。相关论文于2023年12月21日在线发表于国际植物学知名期刊 *The Plant Journal*。
研究背景与目的
本项研究的科学领域聚焦于植物分子生物学，具体关注植物在生长发育过程中如何响应环境信号，特别是光信号和由质体（如叶绿体）发出的逆行信号（retrograde signaling）。光合能力的建立不仅需要光，还需要一个从质体到细胞核的精密信号传导网络。在该网络中，转录因子GLK1（Golden2-like 1）是关键节点，它接收来自质体信号整合子GUN1（Genomes Uncoupled 1）的输入，调控大量光合作用相关核基因（PhANGs）的表达。
研究团队在前期工作中，通过生物信息学分析发现了一个调控高光（HL）应答和逆行信号的核心模块，其中包含GLK1和BBX14。BBX14属于B-box锌指转录因子家族第三支系（Clade III）。然而，BBX14在此信号通路中的具体功能及其与GLK1/GUN1模块的关系尚不明确。因此，本研究旨在深入探究BBX14在模式植物拟南芥中的功能，特别是在光形态建成、高光胁迫适应以及逆行信号通路中的作用，旨在明确BBX14是否是GUN1/GLK1信号传导通路下游的一个关键核内靶标。
详细工作流程
本研究是一个综合性功能研究，涵盖了分子生物学、遗传学、组学分析和生理表型分析等多个层面。其主要流程如下：
1. 基因与突变体验证及基础表型分析 * 研究对象：采用了多种遗传材料。首先，利用T-DNA插入突变体bbx14-1 (Sail_1221_D02)，并通过CRISPR/Cas9技术构建了另外两个敲除/敲低突变体bbx14-2和bbx14-3。作为对照，研究使用了glk1、gun1-102、gun4-2、pifq等多种已知突变体。所有材料背景均为哥伦比亚生态型（Col-0）。 * 实验方法：通过RT-qPCR验证了各突变体中BBX14转录本的表达水平。对bbx14突变体进行基础表型分析，包括测量在暗-光转换早期（2, 4, 8小时）的叶绿素含量积累，以及在正常光照和弱光/抑制剂条件下的下胚轴长度。 * 数据与分析方法：叶绿素含量通过丙酮萃取分光光度法测定。下胚轴长度通过图像分析软件测量，并使用GraphPad Prism进行统计学分析（如双因素方差分析）。
2. 基因组学分析：鉴定GLK1直接靶基因 * 研究对象：构建了在自身启动子驱动下表达GLK1-GFP融合蛋白的转基因拟南芥植株（pGLK1:GLK1-GFP）。 * 实验方法：对14天苗龄的幼苗进行染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）。设置了两种处理：正常生长和添加蛋白酶体抑制剂MG-132及蔗糖处理（以稳定GLK1蛋白）。使用GFP抗体进行免疫沉淀，以Input DNA作为对照。 * 数据与分析方法：利用Trimmomatic、Bowtie2、MACS2等生物信息学软件进行序列修剪、比对和peak calling。通过MEME套件分析peak区域的富集基序。该实验旨在在全基因组范围内鉴定GLK1的直接结合位点。
3. 转录组学分析：探究BBX14功能 * 研究对象：比较野生型Col-0与bbx14-1突变体在两种条件下的转录组：连续黑暗生长（暗形态建成）和暗生长后给予16小时光照再转回8小时黑暗（光形态建成）。 * 实验方法：提取总RNA，构建文库，进行Illumina双端测序（RNA-seq）。 * 数据与分析方法：在Galaxy平台上使用STAR进行序列比对。利用DESeq2等工具分析差异表达基因（阈值设定为表达量变化大于2倍且p值小于0.05）。通过DAVID工具对下调基因进行基因本体（GO）富集分析。
4. 亚细胞定位与信号通路依赖关系验证 * 研究对象：在烟草叶肉原生质体中瞬时表达BBX14-EGFP融合蛋白；分析bbx14、glk1、pifq及gun1等突变体中相关基因表达对质体翻译抑制剂林可霉素（Lin）的响应。 * 实验方法：使用荧光显微镜观察EGFP信号以确定BBX14的亚细胞定位。通过RT-qPCR检测在不同遗传背景和不同处理（如添加Lin或除草剂Norflurazon, NF）下，BBX14、LHCB1.2等标记基因的表达变化。 * 数据与分析方法：RT-qPCR数据归一化至内参基因（如RCE1），并进行统计学显著性检验。
5. 过表达株系构建与表型鉴定 * 研究对象：构建了两种过表达株系：一种是通过农杆菌转化将35S启动子驱动的BBX14融合eGFP或HA标签转入Col-0，得到组成型过表达株系（oeBBX14）；另一种是利用Transplanta库中的β-雌二醇诱导型过表达株系（tpt14）。 * 实验方法：通过Western Blot检测融合蛋白表达水平，通过RT-qPCR检测转录水平。在诱导和非诱导条件下，观察过表达植株的表型（如下胚轴长度、整体形态）及其在NF或Lin处理下的GUN表型。 * 数据与分析方法：对LHCB1.2、CA1（碳酸酐酶1）、RBCS1A（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基1A）等多个光合基因的转录水平进行qPCR验证和/或RNA-seq分析，并与经典gun1突变体进行对比。
6. 高光胁迫耐受性分析 * 研究对象：野生型Col-0、bbx14敲除突变体和BBX14弱过表达株系（oeBBX14）。 * 实验方法：将生长一周的植株从正常光强（80 μmol m-2 s-1）转移至高光条件（1000 μmol m-2 s-1）处理，并在处理后及恢复期监测光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）。 * 数据与分析方法：使用成像PAM叶绿素荧光仪测量Fv/Fm，评估植株的光合系统在高光下的损伤程度及恢复能力。同时测定叶绿素含量变化。
主要研究结果
1. BBX14是GLK1的直接转录靶标 ChIP-seq实验数据清晰地显示，GLK1蛋白特异性结合在BBX14基因转录起始位点（TSS）上游的启动子区域。该区域含有四个与GLK1结合基序（CCAATC）匹配的位点，其中一个位点与已知的蛋白结合芯片鉴定的GLK1结合基序完全一致。这一结果从蛋白质-DNA相互作用层面证实了BBX14是GLK1的直接靶基因，为后续研究BBX14在GLK1下游的功能奠定了基础。分析还发现，除BBX14外，BBX15、BBX16等同支系成员以及其他一些B-box基因也位列GLK1富集结合的前十位靶基因之中。
2. BBX14参与光形态建成和叶绿素早期积累 与野生型相比，bbx14突变体幼苗在从黑暗转入光照的早期（2和4小时），叶绿素积累显著减少，但在8小时后恢复正常水平。这表明BBX14在光触发的叶绿素合成起始阶段扮演着重要角色。此外，bbx14和glk1突变体在正常光下均表现出显著延长的下胚轴表型，类似于弱光下的“避荫反应”，暗示它们在促进光形态建成方面功能相似。有趣的是，当在培养基中添加林可霉素（破坏质体功能，激活逆行信号）后，bbx14和glk1的长下胚轴表型被完全抑制，恢复至野生型水平，且外源添加蔗糖不能逆转这一效应。这强烈表明，bbx14的长下胚轴表型依赖于一个完整的、来自功能性质体的正向逆行信号，而非简单的能量短缺。
3. BBX14可能作为生物钟的调节因子 对bbx14-1突变体的RNA-seq分析发现，在经历光暗转换的幼苗中，有147个蛋白编码基因的表达发生显著改变（变化大于2倍）。其中，下调基因的GO富集分析显著富集到“节律过程”（Rhythmic Process）类别，包括如FKF1、PRR5、TOC1等核心生物钟组分的转录本。这一结果表明，BBX14可能参与调节昼夜节律相关基因的表达。此外，ChIP-hub平台数据显示，BBX14的启动子区域除了结合GLK1，还能结合PIF4、LUX、HY5、ARR10等多个与光/生物钟及细胞分裂素信号相关的转录因子，提示其表达受到复杂网络的调控。
4. 逆行信号对BBX14表达的调控依赖于GUN1 利用Genevestigator数据库和重新分析已发表的RNA-seq数据均发现，BBX14和BBX16的mRNA水平在NF或Lin处理下均会下降，而其他多数BBX基因则无此响应。更重要的是，这种由Lin处理引起的BBX14表达抑制在gun1突变体中几乎完全消失。这表明，在质体发育受阻时，GUN1是抑制BBX14表达所必需的。结合其核定位（原生质体瞬时表达实验证实），BBX14很可能是GUN1/GLK1介导的逆行信号通路下游的一个核内作用节点。
5. 过表达BBX14/BBC15仅能部分重现GUN表型，但不足以被定义为经典GUN突变体 为了测试BBX14是否参与逆行信号传导，研究团队分析了过表达株系。诱导型强过表达株系tpt14在NF处理下，某些光合基因如CA1和RBCS1A的转录水平出现了解抑制，与gun1突变体相似。然而，作为经典逆行信号标志物的LHCB1.2基因，其表达在tpt14中虽有轻微上调但变异性大，且RNA-seq读数可视化分析并未显示其在NF处理下有明确上调。同样，过表达BBX15的植株也仅能解抑制CA1，而不能解抑制LHCB1.2。这与之前报道的BBX16过表达研究结果类似。因此，作者认为，BBX14、BBX15、BBX16可能调控了GLK1下游的一个特定基因子集（包括CA1等），但并未影响LHCB1等核心光合基因的调控。基于对历史标准的严格评估（经典GUN突变体必须显著解抑制LHCB转录本），作者谨慎地决定不将BBX14或BBX15的过表达株系归类为新的GUN突变体。
6. BBX14是植物适应高光胁迫所必需的 数据库分析和实验验证均表明，BBX14的转录本在高光处理下迅速下调。表型分析发现，在高光胁迫下，bbx14突变体的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）相比野生型显著且更快地下降，表明其光合机构更易受损。虽然在高光下能恢复，但其耐受性明显弱于野生型。而过表达BBX14（oeBBX14）的植株表现与野生型相似。这些结果表明，BBX14的正常功能对于植物有效适应高光胁迫至关重要，其表达下调可能是高光响应的一部分，但其蛋白质的存在有助于维持光合系统的稳定性。
结论与意义
本研究系统阐明了拟南芥B-box转录因子BBX14的多重功能。主要结论如下： 1. 功能定位：BBX14是光形态建成和逆行信号通路中的关键因子。它作为GLK1的直接靶基因，在GUN1的下游发挥作用，整合来自质体的生物发生信号，调控幼苗的发育转换。 2. 分子机制：BBX14参与调控叶绿素合成早期事件和生物钟相关基因的表达。其表达本身受到光、生物钟及逆行信号（通过GUN1）的多重调控，构成了复杂的反馈网络。 3. 环境适应：BBX14是植物适应高光胁迫的正向调节因子，缺乏BBX14会降低植物对突然增强的光照的耐受性。 4. 概念厘清：研究提出了关于GUN突变体分类的重要观点。尽管BBX14（及同支系的BBX15、BBX16）位于GUN1/GLK1模块下游并能调控部分光合基因（如CA1），但由于它们不能稳定、显著地解抑制LHCB1等经典标志基因，因此不符合传统GUN突变体的严格定义。这提示GLK1下游的信号通路可能存在分支，不同的靶基因（如BBX家族成员）负责调控不同的基因子集。
本研究的科学价值在于深化了对植物如何整合光信号与质体逆行信号以协调发育与胁迫应答的理解。它揭示了一个由GUN1-GLK1-BBX14/15/16构成的精细调控模块，阐明了B-box蛋白家族成员在信号转导中的特异性功能。在应用价值上，对BBX14在高光应答中功能的认识，为未来通过基因工程手段改良作物对环境胁迫（特别是强光）的适应性提供了潜在靶点。
研究亮点
gun1对比）和回顾历史定义，提出了更审慎的分类标准，这对该领域的研究规范具有重要参考意义。