本研究由Jiangnan University（江南大学）工业微生物研究中心和生物技术学院的Cheng Zhang、Hong Zong、Bin Zhuge*、Xinyao Lu、Huiying Fang、Jiali Zhu和Jian Zhuge团队完成，并发表于2016年的《Biotechnology and Bioprocess Engineering》期刊（卷21期，页码95-102）。研究聚焦于工业酵母Candida glycerinogenes的原生质体制备与聚乙二醇（PEG）介导的遗传转化技术开发，旨在解决该菌株因细胞壁存在导致的传统转化效率低下问题，并为研究其渗透调节机制提供工具。
学术背景
C. glycerinogenes是一种工业化生产甘油的重要菌株，但其分子生物学研究滞后于其他酵母。尽管其生理和发酵特性已有较多探索，关于甘油合成与渗透调节的基因机制仍缺乏深入解析。传统转化方法（如电穿孔和醋酸锂法）对该菌株效率极低，主要障碍在于其细胞壁对DNA摄取的阻碍。因此，开发高效的原生质体制备与再生体系，并结合PEG介导的转化技术，成为突破遗传操作瓶颈的关键。本研究的目标是建立一套优化的原生质体转化系统，并利用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因验证该系统在渗透胁迫研究中的应用潜力。
研究流程与实验方法
1. 原生质体制备与优化
- 酶解条件筛选：比较了商业酶制剂（lyticase和snailase）在不同生长阶段（0-20小时）对原生质体产量的影响。结果表明，lyticase在12小时对数生长后期的菌体中效率最高（98.6%原生质体/mL），优于snailase（53.2%）。
- 渗透稳定剂测试：评估了NaCl、KCl、山梨醇等六种稳定剂。0.6 M KCl和NaCl效果最佳（98.8%产量），但后续再生实验显示糖醇类（如山梨醇）更利于细胞壁重建。
- 关键参数优化：酶解时间（2-3小时为峰值）、pH（6.0最适）和稳定剂浓度（0.6 M）通过正交实验确定。
2. 原生质体再生
- 培养基设计：对比了固体与液体培养基中不同渗透稳定剂（山梨醇、蔗糖、NaCl）的再生效率。1 M山梨醇的固体培养基再生率最高（15%），而NaCl仅支持不足10%的再生。
- 再生机制分析：糖醇类因高粘度特性更利于维持原生质体完整性，而NaCl虽在制备阶段有效，但再生阶段可能因离子毒性抑制细胞壁合成。
3. Zeocin抗性筛选
- 敏感性测试：发现野生型C. glycerinogenes对Zeocin高度敏感，130 μg/mL即可完全抑制未转化原生质体生长，因此选择150 μg/mL作为转化子筛选浓度。
4. PEG介导的转化
- 转化体系构建：采用质粒pURGAP-GFP（含Zeocin抗性基因和C. glycerinogenes的GAP启动子驱动的GFP基因），通过PEG4000（50%浓度）和Li+（75-100 mM）促进DNA捕获。
- 条件优化：35°C孵育20分钟时转化效率最高（45-48转化子/μg DNA），显著高于电穿孔（139转化子/μg）和醋酸锂法（154转化子/μg）。但PEG法的阳性转化率更高，因原生质体对Zeocin更敏感。
5. GFP表达验证
- 基因组整合确认：PCR验证GFP基因成功整合至5.8S rDNA位点（756 bp扩增片段）。
- 渗透胁迫响应：在NaCl（2-20%）、KCl（5-40%）、山梨醇（0.5-2.5 M）和甘油（60-150 g/L）胁迫下，GFP表达强度随胁迫程度升高而增强，且无机盐（NaCl/KCl）的诱导效应强于糖醇类，提示菌株对离子渗透压更敏感。
主要结果与逻辑关联
- 高效原生质体制备：lyticase结合0.6 M KCl的优化方案为后续转化奠定基础。
- 再生体系确立：1 M山梨醇固体培养基的高再生率（15%）确保了转化后细胞的存活。
- 转化效率提升：PEG法虽绝对转化数较低，但因筛选严格性更适合该菌株。
- GFP应用验证：胁迫依赖性表达证实该系统可用于研究C. glycerinogenes的渗透调节网络。
结论与价值
本研究首次建立了C. glycerinogenes的原生质体-PEG转化系统，其科学价值在于：
1. 方法学创新：突破了该菌株遗传操作的瓶颈，为基因功能研究（如甘油合成途径）提供工具。
2. 应用潜力：GFP报告系统可用于快速评估启动子活性或胁迫响应，助力工业菌株改造。
3. 普适性启示：方案可推广至其他Candida属酵母或工业酵母的遗传改良。
研究亮点
- 原生质体制备的精细化调控：首次系统评估了酶类型、生长阶段和渗透稳定剂的协同效应。
- 转化-再生耦合优化：发现山梨醇在再生阶段的不可替代性，揭示了糖醇类对细胞壁重建的关键作用。
- 胁迫响应分析：通过GFP动态表达量化了菌株对不同渗透剂的敏感性差异，为后续代谢工程提供数据支持。
其他价值
文中开发的pURGAP-GFP载体（含内源GAP启动子）可扩展用于其他外源蛋白表达研究。此外，原生质体对Zeocin的超敏感性为类似工业酵母的筛选标记设计提供了新思路。