CRISPR-DNA聚合酶辅助的可调控实验室定向进化系统：一项高效、广谱的靶向突变技术研究

作者及机构
本研究由Shuaili Chen、Xiangdi Chen、Yifan Peng、Qinghua Li、Jingwen Zhou、Jianghua Li、Guocheng Du、Jian Chen和Guoqiang Zhang*共同完成，团队来自中国江南大学未来食品科学中心（Science Center for Future Foods, Jiangnan University）、工业生物技术教育部重点实验室（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education）及江苏省合成生物学基础研究中心（Jiangsu Province Basic Research Center for Synthetic Biology）。研究成果发表于《Advanced Science》期刊，2025年在线发表，开放获取，DOI: 10.1002/advs.202511448。

学术背景
定向进化（laboratory evolution）是生物技术、制药和工业应用中优化生物分子及生物系统的核心策略。然而，传统方法依赖自然突变率（10⁻⁹–10⁻¹¹/碱基/代），耗时长且效率低。现有靶向超突变工具（targeted hypermutation tools）如CRISPR-X和EvolvR存在突变窗口狭窄（<350 bp）、突变类型受限或脱靶率高等问题。本研究旨在开发一种新型靶向突变系统CRISPR-TDNAP（CRISPR-TDNAP-assisted Targeted Mutagenesis for Regulable Laboratory Evolution, CTRLE），通过整合高持续性的噬菌体T5/T7 DNA聚合酶（DNA polymerase, DNAP）与CRISPR-Cas9，实现长片段（2 kb）全类型核苷酸替换，并降低脱靶效应。

研究流程与实验设计

1. 突变体构建与优化

   • 突变体设计：选择三种高错误倾向的DNA聚合酶变体（T5 DNAP3M、T5 DNAP4M、T7 DNAP3M），通过23个氨基酸的接头与nCas9（nickase Cas9）融合。T5 DNAP因具有链置换活性（strand-displacing activity）而被优先测试。
     
   • 表达系统：使用四环素诱导型启动子（ptet）控制突变体表达，以含提前终止密码子的壮观霉素抗性基因（aada*）作为报告基因。
     
   • 突变率测试：在E. coli TG1中，T5 DNAP4M-nCas9的靶向突变率较野生型提高7.08×10⁵倍（1 bp处），且突变窗口扩展至2 kb（突变率保持10⁻⁷/碱基/代）。
     

2. 脱靶率控制

   • MS2-MCP招募系统：通过MS2衣壳蛋白（MCP）与T5/T7 DNAP融合，利用sgrNA上的MS2发夹结构（MS2 hairpin loops）实现聚合酶靶向定位。该策略使T5 DNAP4M脱靶率降低96.8%（从43倍降至接近野生型水平）。
     
   • SpyTag/SpyCatcher系统：作为替代方案，虽降低脱靶率，但靶向效率显著下降，最终选择MS2-MCP为核心策略。
     

3. 时空调控系统开发

   • dTnPB转录抑制：通过脱活的TnPB（dTnPB）靶向ptet启动子，在阿拉伯糖诱导下抑制突变体表达，实现泄漏表达控制。实验显示，dTnPB系统可将泄漏突变率降至背景水平，同时保留诱导后的高效突变能力。
     

4. 应用验证

   • 多重基因组位点进化：在E. coli中同步靶向rpob、rpse和rpsl基因（分别介导利福平、壮观霉素和链霉素抗性）。经过8天连续传代（12轮），获得三重抗生素抗性菌株（MIC从0提升至200 μg/ml）。
     
   • TAT转运途径优化：靶向tatABC基因簇（2 kb窗口），6天内使大肠杆菌周质蛋白分泌效率提升3倍，并通过β-内酰胺酶活性筛选获得高活性突变体（如TatC E244G）。
     
   • 跨物种适用性：在B. subtilis和K. lactis中，CTRLE的靶向突变率分别达宿主背景的1.2×10⁵倍和5×10⁷倍，证实其广谱性。
     

主要结果与逻辑关联
1. 突变效率与窗口扩展：T5 DNAP4M-nCas9在1 bp处的突变率为1.07×10⁻⁵/碱基/代（图1b），且2 kb处仍保持10⁻⁷水平（图S2c），归因于T5 DNAP的高持续性（processivity）。
2. 脱靶控制机制：MS2-MCP系统通过空间分离nCas9与DNAP，减少非特异性结合，使T5 DNAP4M的脱靶率从43倍降至1.4倍（图2d）。
3. 动态调控验证：dTnPB系统在无诱导条件下将泄漏表达压制至野生型水平（图3c），确保突变过程的可控性。
4. 应用实例：三重抗生素抗性菌株的获得（表1）和TAT途径优化（图5e）证明CTRLE在复杂性状进化中的高效性。

结论与价值
1. 科学价值：CTRLE首次将噬菌体DNAP的高持续性与CRISPR靶向性结合，突破现有工具在突变窗口和类型上的限制，为长基因或通路进化提供通用方案。
2. 应用潜力：可加速工业酶、抗生素耐药机制研究和微生物细胞工厂的优化，如提升蛋白分泌或代谢产物合成效率。

研究亮点
1. 创新性方法：MS2-MCP招募系统和dTnPB调控模块为合成生物学工具开发提供新范式。
2. 高效性与广谱性：2 kb突变窗口和跨物种适用性（细菌/酵母）远超同类工具（如EvolvR）。
3. 低脱靶率：MS2策略将脱靶率压制至近背景水平，优于SpyTag等替代方案。

其他价值
本研究为多基因同步进化和复杂表型筛选（如抗生素抗性组合进化）建立了标准化流程，相关质粒和实验方案已公开，可供领域内直接应用。