本研究由Pascal Haffter和Thomas D. Fox完成，作者隶属于康奈尔大学遗传学与发育学系（Section of Genetics and Development, Cornell University）。该论文于1992年6月发表在《Genetics》杂志第131卷第255至260页。研究的主要科学领域为线粒体遗传学与酵母分子遗传学，研究对象为裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe，以下简称S. pombe）。

在学术背景方面，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）属于“小菌落阳性”（petite-positive）酵母，经溴化乙锭（ethidium bromide）处理后可高效产生完全丧失线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的rho⁰突变株，且这些rho⁰细胞仍可存活。然而，S. pombe一直被认为是“小菌落阴性”（petite-negative）酵母，此前从未获得过完全缺失mtDNA的存活菌株。已有研究表明，S. pombe经溴化乙锭处理后虽然mtDNA拷贝数下降并最终停止生长，但恢复后的活细胞仍含有完整且功能正常的线粒体基因组。这一现象引出一个假说：S. pombe的细胞存活可能依赖于线粒体基因表达所介导的某些非呼吸相关的重要功能。然而，鸡胚成纤维细胞和人类细胞均已通过溴化乙锭处理获得了rho⁰细胞系，这使得S. pombe中无法获得rho⁰菌株的现象显得令人困惑。因此，本研究旨在尝试通过长时间培养从S. pombe中分离rho⁰菌株，并探讨其存活依赖的遗传基础。

在研究流程方面，作者首先对S. pombe菌株FYC11进行了溴化乙锭诱导实验。初始尝试在含有葡萄糖的完全培养基（YES）中添加12.5 μg/ml溴化乙锭，但未获得非呼吸突变株。考虑到动物细胞中嘧啶生物合成依赖呼吸功能，作者还尝试在含溴化乙锭的YES培养基中补充50 μg/ml尿苷和100 μg/ml丙酮酸，但仍未获得rho⁰菌株。随后，作者将FYC11接种于含12.5 μg/ml溴化乙锭和2%醋酸钾的YES培养基中，经17天长时间培养后，从该培养物中获得了非呼吸菌株。将该培养物涂布于含2%醋酸钾的YES固体培养基上获得单菌落，再影印至含非发酵碳源乙醇和甘油的YPEG培养基上，发现所有菌落均不能在YPEG上生长，提示它们可能缺乏mtDNA。其中一个菌株被命名为PHP4，用于后续分析。

为了排除PHP4为污染物的可能性，作者检查了其营养缺陷型标记和交配能力。结果显示，PHP4与亲本菌株FYC11一样需要腺嘌呤才能生长，并且能与ura1菌株FYC8交配产生原养型单倍体重组子代，证明其为真正的S. pombe菌株。接着，作者通过凝胶印迹杂交（gel-blot hybridization）分析PHP4的总DNA。使用含有S. pombe完整mtDNA的质粒pDG3作为探针时，FYC11中检测到了预期的mtDNA限制性酶切图谱，而PHP4中未检测到任何与S. pombe mtDNA杂交的序列。为验证检测灵敏度，作者还使用两个随机选取的核DNA单拷贝克隆（ph1和ph4）作为探针进行对照杂交，结果显示FYC11和PHP4的总DNA均给出了相同的杂交信号，证明实验方法足以检测单拷贝序列，并进一步确认PHP4确实不含mtDNA。此外，作者还利用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色对rho⁰菌株PHP14及其rho⁺亲本PHP3进行了显微镜观察。结果显示两种细胞的细胞核均清晰可见，但只有rho⁺细胞中存在分布于整个细胞质的mtDNA斑点状染色，rho⁰细胞中则没有，从而从细胞学角度确认了mtDNA的缺失。

在研究过程中，作者发现rho⁰诱导具有不可重复性。例如，在8个独立的PHP3培养物中，仅有两个经15天溴化乙锭处理后产生了非呼吸菌株。作者推测，这种不可重复性可能是因为溴化乙锭导致mtDNA拷贝数下降至细胞停止生长的水平，但在长时间培养过程中，某些培养物中发生了核突变（nuclear mutation），使细胞能够在没有mtDNA的情况下继续生长。为验证这一假说，作者将rho⁰菌株PHP14与rho⁺菌株FYC9进行杂交，并对所得四分体（tetrad）进行解剖分析。核标记（交配型、ura1、ade6、leu1）均呈2:2分离。随后对6个四分体的全部四个孢子进行溴化乙锭处理，结果每个四分体中均有两个孢子在8天内迅速产生rho⁰细胞，而另外两个孢子则不能，表明快速形成rho⁰的能力在该杂交中呈2:2分离。作者将这一核突变命名为ptp1-1（petite-positive的缩写）。为进一步确定独立分离的rho⁰菌株PHP4是否携带ptp1突变或其他核基因突变，作者将带有ptp1-1的rho⁺菌株PHP25与PHP4杂交并解剖了20个四分体。如果两个菌株均携带ptp1突变，则每个四分体的四个孢子均应能迅速产生rho⁰细胞；但如果PHP4携带的是一个不连锁的不同核基因突变，则预期会产生亲代双型（parental ditype）、非亲代双型（nonparental ditype）和四型（tetratype）的比例为1:1:4。实际结果为：1个亲代双型、2个非亲代双型和17个四型，符合两个不连锁基因的预期分离。因此，作者认为PHP4含有与ptp1不连锁的核突变ptp2-1。

在主要结果方面，本研究首次成功分离了完全缺失mtDNA的S. pombe rho⁰菌株。这些rho⁰菌株在含葡萄糖的完全培养基上生长明显慢于对应的rho⁺菌株，且在含乙醇和甘油的培养基上完全不生长，同时在液体培养基中表现出絮凝（flocculent）表型。但它们不需要醋酸钾或其他特殊生长因子。遗传分析表明，S. pombe rho⁰菌株的存活依赖于核突变。至少两个不连锁的基因（ptp1和ptp2）发生突变后，可以使S. pombe在缺失mtDNA的情况下生长，且这些ptp突变在rho⁺背景中不产生其他可检测的表型。醋酸钾在rho⁰诱导过程中似乎是必需的，因为在不含醋酸钾的培养基中作者从未获得rho⁰菌株；然而，rho⁰菌株一旦建立后，无论是否存在醋酸钾，其生长速率相同，说明醋酸钾的作用并非补偿rho⁰菌株的代谢缺陷，其具体机制尚不明确。

在结论方面，本研究证明S. pombe的“小菌落阴性”特性并非由于其线粒体基因组中存在某种对细胞存活力至关重要的独特基因表达。单个核突变即可克服野生型S. pombe在缺乏mtDNA时无法生长的限制，且不引起其他可检测的表型变化。这一发现与酿酒酵母中的情况形成了有趣的对照：酿酒酵母中一个名为op1的核突变可阻止rho⁻和rho⁰细胞生长，实际上将酿酒酵母转变为“小菌落阴性”酵母，而该突变已被证明影响编码线粒体ATP/ADP转运蛋白（ATP/ADP translocator）的基因。因此，作者推测本文描述的ptp突变可能影响ATP/ADP转运蛋白的活性。此外，作者还提到一株通过原生质体融合获得的乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）菌株也能耐受rho⁻和rho⁰突变，但其机制尚不清楚，可能涉及类似于ptp突变的核基因改变。

本研究的科学价值在于首次证明了S. pombe可以在核突变辅助下完全丧失mtDNA而存活，从而揭示了“小菌落阴性”表型的遗传可塑性。其应用价值在于，S. pombe rho⁰菌株的获得为线粒体遗传操作提供了有用的受体，类似于酿酒酵母rho⁰菌株在线粒体转化中的重要作用。尽管本文未实现线粒体转化，但作者指出这些rho⁰菌株可能对S. pombe线粒体功能分析具有潜在应用价值。研究亮点包括：通过极长时间溴化乙锭处理结合醋酸钾添加成功获得rho⁰菌株；发现rho⁰诱导的不可重复性源于核突变的随机发生；通过四分体分析鉴定出两个不连锁的ptp基因；以及通过凝胶印迹杂交和DAPI染色双重确认mtDNA的完全缺失。这些发现为理解线粒体基因组在真核细胞存活力中的作用提供了新的视角，并为后续线粒体遗传学研究开辟了新的实验途径。