本研究由Yu-Jun Zhang、Wen-Xia Zhang、Gao-Wei Zheng和Jian-He Xu等人完成，他们来自华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering）和上海生物制造协同创新中心（Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacture）。该研究成果于2015年4月29日在线发表于期刊 *Advanced Synthesis & Catalysis*，论文DOI为10.1002/adsc.201500001。研究的主要目标是寻找一种能够高效不对称还原ε-酮酯（ε-keto ester）——8-氯-6-氧代辛酸乙酯（ethyl 8-chloro-6-oxooctanoate, ECOO）——的新型还原酶，并建立一种可用于工业化生产®-α-硫辛酸（®-α-lipoic acid, ®-LA）关键手性前体的高效生物催化方法。
®-α-硫辛酸是一种具有重要药用价值的手性化合物，仅R构型具有生物活性，被用于治疗糖尿病神经病变、辐射损伤、急性和慢性肝病，并作为膳食补充剂使用。合成®-α-硫辛酸的关键手性中间体是光学纯的®-8-氯-6-羟基辛酸乙酯（ethyl ®-8-chloro-6-hydroxyoctanoate, ®-ECHO）。目前工业上主要采用化学拆分法，从ECOO经硼氢化钠（NaBH₄）还原得到外消旋混合物后再进行拆分，但最大收率只有50%，操作复杂且经济性差。相比之下，通过前手性ε-酮酯ECOO的不对称生物还原直接构建手性中心（路线2）具有理论收率100%、不产生不需要的(S)-对映体、减少废物和简化流程的优势。然而，此前报道的若干微生物或酶在底物耐受性、立体选择性或生产效率方面均存在明显不足，限制了该路线的工业化应用。因此，本研究的目标是筛选并鉴定一种具有高活性、高立体选择性和高底物耐受性的新型ε-酮酯还原酶，并开发一种可放大的高效生物催化工艺。
为了实现这一目标，研究团队设计了多层次的筛选策略。首先，他们对本实验室已有的还原酶工具箱进行了筛选，包括CgKR1、CgKR2、YtBE、KtCR、ScCR和ArQR等对酮酯或酮具有优良性能的酶。然而，这些酶对结构上与α-酮酯和β-酮酯明显不同的ECOO均表现不佳，表明ECOO的还原需要特殊的酶。随后，由于酵母如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）常被用作酮酯还原的生物催化剂，他们对多种酵母进行了筛选，并鉴定出若干能将ECOO转化为ECHO的微生物。在此基础上，他们采用了生物信息学策略，以来自Metschnikowia zobellii的已知对ECOO具有高活性的氧化还原酶MZCR为探针，通过pBLAST搜索，从这些宿主细胞预测的数千种还原酶中筛选出若干候选氧化还原酶，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行了过表达和活性评价。这些候选酶包括来自Candida parapsilosis的CPAR1（GenBank登录号CCE40009.1）、CPAR2（CCE40410.1）和来自S. cerevisiae的ScAR1（EDV10271.1），它们分别与MZCR具有47%、46%和44%的氨基酸序列一致性。实验结果显示，CPAR1的比活力为6 U/mg湿细胞（U mg⁻¹），ScAR1为14 U mg⁻¹，但它们对ECOO的不对称还原产物ECHO的对映体过量值（ee）分别只有87%（S构型）和83%（R构型），立体选择性不足。CPAR2则表现出最高的比活力（53 U mg⁻¹）和优异的对映选择性（>99% ee），因此被选为后续研究的目标酶。
接下来，研究团队对CPAR2进行了酶学性质表征。他们使用N末端His标签重组还原酶CPAR2并将其纯化至电泳均一。纯化后CPAR2的比活力为120 U mg⁻¹蛋白质。动力学参数测定显示，其Km为1.17 mM，Vmax为148 μmol min⁻¹ mg⁻¹，催化效率（kcat/Km）为77 s⁻¹ mM⁻¹。这些结果表明CPAR2能够在高底物浓度下有效转化ECOO。他们还考察了CPAR2的底物谱，包括脂肪族酮、芳香族酮、α-酮酯、β-酮酯和ε-酮酯ECOO。结果显示，CPAR2对酮酯的活性高于对酮的活性，并且对ε-酮酯ECOO表现出最高的活性。这一结果强调了该酶具有较大的催化口袋以适应ECOO中羰基与酯基之间较长的距离，也说明高效的ε-酮酯还原酶较为稀有且具有较高价值。
为了避免在实际制备应用中添加昂贵的辅酶，研究团队构建了由葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase, GDH）和CPAR2组成的辅酶再生耦合系统。他们构建了多种共表达质粒，将来自Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶（BmGDH）基因和CPAR2基因同时在大肠杆菌中共表达。实验发现，带有质粒pET28a-CPAR2-BmGDH的大肠杆菌细胞中两种酶均表现出优良活性，因此该重组细胞被用作后续不对称还原ECOO的催化剂。
在反应条件优化阶段，他们使用冻干的大肠杆菌细胞（pET28a-CPAR2-BmGDH）进行了ECOO的不对称还原。结果表明，当底物浓度为22 g/L时，反应在2小时内转化率达到99%以上。当底物浓度提高到110 g/L时，反应在8小时内可以完全转化。当底物浓度进一步增加到220 g/L时，在相同细胞用量（10 g/L）下12小时仅获得87%转化率。将细胞用量提高到20 g/L后，无需额外添加NADP⁺即可在12小时内实现220 g/L底物的完全转化。更有意义的是，在220 g/L底物浓度下添加0.1 mM NADP⁺时，330 g/L的ECOO也能在13小时内达到99%以上转化率；如果不添加外源NADP⁺，330 g/L底物在24小时内也可达到98%转化率。所有反应中产物®-ECHO的ee值均高于99%。这些结果表明，在极高底物浓度下，细胞内辅酶NADP⁺/NADPH的含量可能不足以支撑反应，但通过适当提高细胞量或少量补充外源辅酶即可有效解决这一问题。
在优化的反应条件下，研究团队将不对称还原反应放大至1 L规模，底物浓度为330 g/L。结果显示，13小时内底物转化率和产物ee值均超过99%。经过乙酸乙酯萃取和常规后处理后，®-ECHO的分离收率为86%，时空产率（space-time yield, STY）达到530 g L⁻¹ d⁻¹。为了验证该工艺的实际可行性，他们还在10 L规模上进行了公斤级中试反应，结果与1 L规模一致，表明该工艺可以成功放大。作者预计在不久的将来可实现®-ECHO的大规模酶法生产。
与以往报道的生物催化剂相比，CPAR2表现出明显优势。例如，Geotrichum candidum DSM 13776细胞在底物浓度5 g/L、24小时条件下的产物ee仅为88%，STY为3 g L⁻¹ d⁻¹；来自Thermoanaerobium brokii的TBADH虽然产物ee达到99.5%以上，但底物浓度仅2 g/L；来自Nocardia globulera的NGADH在44 g/L底物浓度下24小时转化率为95%，STY为42 g L⁻¹ d⁻¹；来自Metschnikowia zobellii的MZCR在85 g/L底物浓度、0.1 mM NADP⁺、24小时条件下转化率仅55%，STY为47 g L⁻¹ d⁻¹。相比之下，本研究的CPAR2体系在330 g/L底物浓度、0.1 mM NADP⁺、13小时内即可实现>99%转化率和>99% ee，STY高达530 g L⁻¹ d⁻¹，显著优于已有方法。
本研究从Candida parapsilosis中分离并鉴定了一种新型ε-酮酯还原酶CPAR2。该酶对ECOO具有极高的催化活性和优异的对映选择性，结合葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统，在大肠杆菌中共表达后，成功实现了®-ECHO的高效不对称合成。该生物催化工艺具有底物浓度高（330 g/L）、转化率高（>99%）、产物ee高（>99%）、时空产率高（530 g L⁻¹ d⁻¹）以及可放大至10 L规模等突出优点，为®-α-硫辛酸的绿色、低成本工业化生产提供了一条优于现有化学拆分路线的可行途径。此外，该研究也表明基于生物信息学的酶筛选策略可以有效地从微生物基因组中挖掘针对特殊底物的新型高效还原酶，为其他手性中间体的生物催化合成提供了有益的参考。