《过程生物化学》期刊（Process Biochemistry）于2012年刊载了由E. Durand, J. Lecomte, B. Baréa, G. Piombo, E. Dubreucq, P. Villeneuve等研究人员共同完成的一项原创性研究。其中，第一作者E. Durand及其主要通讯作者P. Villeneuve均来自法国蒙彼利埃的国际农业研究发展中心（CIRAD）和国际农业热带食品环境联合研究单位（UMR IATE），部分合作者亦来自蒙彼利埃高等农学院（Montpellier SupAgro）。该研究题为“评估低共熔溶剂作为南极假丝酵母脂肪酶催化反应的新介质”，旨在探索一系列低共熔溶剂在作为生物转化“绿色溶剂”方面的潜力与局限。
本研究的学术背景聚焦于酶催化，特别是脂肪酶在非水介质中催化合成反应的应用，属于生物催化与绿色化学交叉领域。脂肪酶（如南极假丝酵母脂肪酶B，Candida antarctica lipase B， CALB）因其能在有机溶剂中催化酯化、转酯化等多种反应，在食品、化妆品、制药及生物柴油工业中具有广泛应用。然而，传统有机溶剂通常具有毒性、挥发性且对环境不友好。尽管离子液体（Ionic Liquids）曾被视作一种有潜力的替代品，但其存在成本高、毒性不明、纯度要求严苛等缺点。在此背景下，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）作为一种新兴的绿色溶剂类别引起了研究者们的注意。DESs通常由季铵盐（如氯化胆碱）和氢键供体（如尿素、甘油）混合而成，具有熔点低、挥发性低、热稳定性好、生物可降解、成本低廉且易于制备等优点。然而，在2012年该研究进行时，关于DESs作为酶催化反应介质，尤其是针对脂肪酶催化的转酯化反应，其适用性、影响因素及潜在问题的系统性研究尚不充分。因此，本研究的主要目标在于：分析多种DESs作为固定化CALB生物转化介质的优势与局限性；以乙烯基月桂酸酯与不同链长醇的转酯化为模型反应，评估底物极性的影响；探究DESs中氢键供体与底物发生竞争性副反应的可能性；并比较CALB在DESs与传统有机溶剂中的活性、选择性及长期稳定性。
详细的工作流程可分为几个关键步骤，涉及DESs的制备、酶的处理、反应条件优化、活性与选择性测定以及长期稳定性评估。
首先，研究人员合成了七种不同的DESs，其组成基于文献中已报道的低共熔点混合物。选用的季铵盐包括氯化胆碱（Choline Chloride, ChCl）和乙铵氯（Ethylammonium Chloride, EAC）；氢键供体则涵盖了尿素（Urea, U）、甘油（Glycerol, Gly）、乙二醇（Ethylene Glycol, EG）、草酸（Oxalic Acid, Ox）和丙二酸（Malonic Acid, Mo）。所有组分在使用前均经过干燥处理。DESs的合成通过将铵盐与氢键供体按特定摩尔比（1:1或1:2）直接混合，并在60°C下加热搅拌约2小时，直至形成无色透明液体。合成后立即测定了各DESs的初始含水量（均低于1%，w/w），并发现DESs具有极强的吸湿性，在饱和盐溶液控制的湿度环境中难以达到预期的低水平水分平衡，因此后续所有反应均在密封容器中进行，并控制催化剂的初始水活度为0.44。
其次，在开始生物催化实验前，研究团队发现了一个至关重要的预处理步骤：固定化脂肪酶（商品名Novozym® 435）的研磨。由于DESs具有高粘度，导致质量传递受限，未研磨的固定化酶颗粒（直径0.3-0.9 mm）在DESs中分散不均，反应动力学结果不可重复且不一致。因此，他们使用研磨机将固定化脂肪酶颗粒研磨至0.100–0.165 mm的粒径，以显著改善其在粘稠DES介质中的分散效果，从而获得可靠且可重复的初始反应速率数据。这一步骤是本研究方法学上的一个关键点。
第三，模型反应为CALB催化的乙烯基月桂酸酯与醇的转酯化反应。选用三种链长不同的伯醇作为亲核底物：1-丁醇（C4）、1-辛醇（C8）和1-十八醇（C18），以评估底物极性（疏水性）在DESs中的影响。乙烯基酯作为酰基供体，其优点在于反应中生成的乙烯醇会异构化为乙醛并逸出，使反应平衡向合成方向移动，且乙烯基在195 nm处有强紫外吸收，便于通过紫外分光光度法快速监测反应进程。反应通用条件如下：在含有1 mL DES和1 mg研磨后CALB（aw预先调至0.44）的密封反应瓶中，于40、50或60°C下孵育30分钟，然后加入40 μmol乙烯基月桂酸酯和240 μmol相应醇，进行磁力搅拌。反应进程通过定时取样，用盐酸淬灭，正己烷萃取，然后结合紫外光谱和带有火焰离子化检测器的气相色谱进行分析。产物通过气相色谱-质谱联用技术进行鉴定。
第四，为了探究DESs组分（氢键供体）本身是否作为底物参与竞争性反应，研究设置了对照实验：将CALB在DESs中孵育16小时，但不添加任何外源醇，随后分析反应混合物，以检测是否有来自氢键供体的酯类副产物生成。
第五，评估了CALB在选定DESs中的长期稳定性。方法是将研磨后的CALB在50°C下于DESs（或作为对照的甲苯）中预先孵育1、2、3和5天，之后加入底物（乙烯基月桂酸酯和辛醇）启动转酯化反应，并测定初始比活性，与未预先孵育的酶活性进行比较，以计算活性保留率。
在数据分析方面，初始比活性通过反应最初5分钟内的底物消耗速率计算（μmol/min/mg）。转化率和选择性通过气相色谱的峰面积百分比确定。所有实验均重复三次。研究通过比较不同DESs、不同醇、不同温度下的活性与选择性数据，并结合副产物分析，系统地评估了各DESs的性能。
本研究取得了一系列明确且富有层次的结果，逐步揭示了DESs作为脂肪酶反应介质的复杂特性。
首先，关于不同DESs中脂肪酶的总体活性和底物链长影响。在60°C下进行16小时的反应后，发现在基于氯化胆碱的DESs中，ChCl:U和ChCl:Gly对所有三种链长的醇都表现出优异的性能，乙烯基月桂酸酯转化率均达到100%，且选择性高于99%，其效果与广泛使用的有机溶剂甲苯相当。相比之下，基于二羧酸（ChCl:Ox, ChCl:Mo）和乙二醇（ChCl:EG）的DESs则表现不佳，转化率较低且常伴随副反应。基于乙铵氯的DESs（EAC:U, EAC:Gly）活性普遍较低，尤其是EAC:Gly在所有反应中活性均很差。值得注意的是，当聚焦于初始比活性（反映反应初速）时，一个关键发现是：在ChCl:U和ChCl:Gly这两种性能最佳的DESs中，醇的链长（从C4到C18）对酶活性的影响远小于在甲苯中。在甲苯中，随着醇的疏水性增加（从丁醇到十八醇），初始活性显著提高，这是有机溶剂中脂肪酶催化反应的典型特征。然而，在ChCl:Gly中，醇链长的影响几乎可以忽略不计；在ChCl:U中，影响也存在但弱于甲苯。这表明在DESs这种特殊的溶剂环境中，底物极性与酶活性之间的传统关联被改变了，CALB对疏水性底物的偏好性减弱。
其次，关于氢键供体反应性的研究揭示了DESs用作酶反应介质的一个重要潜在问题。通过不添加外源醇的对照实验，质谱分析证实了显著的副反应发生。在ChCl:EG中，乙二醇作为氢键供体，会与乙烯基月桂酸酯反应，生成乙二醇单月桂酸酯和二月桂酸酯。当存在外源醇时，乙二醇的竞争反应会受到抑制，且抑制程度随外源醇链长增加而增强，但目标烷基酯的产率仍然很低。在基于二羧酸（草酸、丙二酸）的DESs中，情况更为复杂和不利。二羧酸会与醇（尤其是中等链长的辛醇）反应，生成单酯和双酯副产物。与ChCl:EG不同，二羧酸的反应性不受是否存在乙烯基酯的影响，并且反应导致体系粘度进一步急剧增加，严重阻碍搅拌和物质传递。这些副反应不仅降低了目标产物的产率和选择性，更破坏了DESs自身的组成和物理性质（如粘度），使其难以回收利用。相反，在ChCl:U和ChCl:Gly中，即使长时间孵育，也未检测到尿素或甘油与底物发生显著反应的证据，说明这些氢键供体在DESs中由于与氯化胆碱之间形成了强氢键网络，其反应性被大大降低，从而保持了溶剂的稳定性和反应的选择性。
第三，关于温度的影响。研究发现，提高反应温度（从40°C升至60°C）能有效降低DESs的粘度，从而将ChCl:U和ChCl:Gly中的初始比活性提高约1.5倍。这表明，使用热稳定性高的固定化脂肪酶，并通过升温来克服DESs高粘度带来的传质限制，是一个可行的策略。
第四，关于CALB在DESs中的长期稳定性。稳定性测试结果与活性、选择性数据相呼应，进一步区分了不同DESs的适用性。在ChCl:U中，CALB表现出良好的稳定性，孵育1天后活性仅损失5%，孵育5天后活性保留率仍高于62%。在ChCl:Gly中，稳定性稍差，孵育5小时后活性即下降约65%，但在随后的1至5天孵育中，活性未进一步显著下降，表明酶在短时间内达到了一个稳定的构象状态。研究者推测，甘油可能吸附在催化剂表面，短期内影响了疏水底物向活性位点的扩散，但并未导致酶的持续变性失活。相比之下，在甲苯中，CALB的稳定性最好，5天孵育后活性仅损失15%。尽管ChCl:Gly中的稳定性不及甲苯，但其活性在初始下降后能维持数天，这对于需要较长反应时间的复杂合成过程而言是可接受的。
基于以上结果，本研究得出了明确的结论：并非所有低共熔溶剂都适合作为脂肪酶催化反应的有效介质。要实现高效的生物催化，需要满足特定条件。首先，对于固定化CALB，预先研磨以改善其在粘稠DESs中的分散是必要步骤。其次，DESs中氢键供体的反应性是决定其能否使用的关键因素。像ChCl:EG和基于二羧酸的DESs，其氢键供体会与底物发生竞争性副反应，导致副产物生成、DES组成破坏和粘度剧增，因此不适用于以醇或羧酸酯为底物的转酯化反应。然而，以尿素或甘油为氢键供体、与氯化胆碱组成的DESs（ChCl:U和ChCl:Gly），则表现出巨大的应用潜力。在这些DESs中，强氢键作用抑制了氢键供体自身的反应性，使得CALB能够保持高活性和高选择性，其催化效率可与传统有机溶剂媲美。此外，CALB在这些DESs中的催化行为表现出一个独特优势：其活性受醇底物链长的影响较小，这拓宽了其可用于底物的极性范围。同时，CALB在ChCl:U和ChCl:Gly中具有良好的操作稳定性，能够维持数天的活性，足以进行较长时间的反应。因此，以氯化胆碱为基础，搭配尿素或甘油的DESs，因其低成本、易得、可生物降解、对酶友好且性能优异，被视为用于脂肪酶催化反应的极具前景的绿色溶剂。
本研究的科学价值在于，它首次系统、深入地评估了多种DESs在工业上最重要的脂肪酶之一——CALB催化的转酯化反应中的综合性能，不仅测定了活性，还深入探究了底物极性影响、溶剂组分竞争反应和酶长期稳定性等关键问题。研究揭示了DESs作为酶反应介质时区别于传统有机溶剂的独特行为（如减弱底物链长影响），并明确了氢键供体反应性是评估DESs适用性的核心判据之一。在应用价值方面，该研究为在绿色化学框架下进行脂肪酶催化合成（如香料酯、生物柴油前体、手性药物中间体等）提供了具体可行的溶剂选择（ChCl:U和ChCl:Gly）和操作方案（如酶研磨、控温、控水），推动了DESs在工业生物催化领域的实际应用探索。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，重要的发现：明确指出ChCl:U和ChCl:Gly是适用于CALB转酯化反应的优异DESs，并首次详细报道了在DESs中CALB活性受醇链长影响较小的现象，以及部分DESs中氢键供体引发竞争性副反应并破坏溶剂体系的机制。第二，方法的创新性：首次提出并证实了对固定化CALB进行研磨预处理，是克服DESs高粘度、获得可靠酶动力学数据的必要步骤，这是方法学上的一个重要贡献。第三，研究对象的特殊性：系统评估了多种具有不同氢键供体的DESs，并与传统有机溶剂进行了多维度（活性、选择性、稳定性、底物效应）对比，研究全面而深入。第四，对后续研究的指导价值：该研究为其他酶在DESs中的行为研究提供了有价值的范式和警示，即必须评估溶剂组分与底物/产物的潜在相互作用以及酶的物理分散问题。这项研究为低共熔溶剂在生物催化领域的应用奠定了坚实的实验基础，并指明了进一步发展的方向。