本文档是由日本国立遗传学研究所（National Institute of Genetics, Mishima, Japan）的木村资生（Motoo Kimura）于1987年发表在《Journal of Molecular Evolution》上的论文，题为“Molecular Evolutionary Clock and the Neutral Theory”（分子进化钟与中性理论）。本文是一篇理论阐述与数据分析相结合的文章，旨在从中性理论（Neutral Theory）的立场探讨分子进化钟（Molecular Evolutionary Clock）的准确性、影响因素及其理论基础，并非报告一项单一的原始实验研究。因此，它属于类型b：一篇综合性的观点阐述与论证性论文。

本文的核心论题是，分子进化钟的存在和表现可以用中性理论来优雅地解释。分子进化钟现象，即特定蛋白质或DNA序列的进化速率在不同谱系间大致恒定，是分子进化领域一个引人注目的特征。然而，其精确性及其背后的机制一直存在争议。木村资生，作为中性理论的主要提出者，在这篇论文中系统性地从中性理论视角出发，构建了解释分子进化钟的理论框架，并运用统计学方法分析实际蛋白质数据，论证了导致进化钟“不准”（即速率变化）的两个主要因素，同时反驳了当时一些基于选择论（selectionist）观点对中性理论的质疑。

论文的主要观点和论证结构如下：

第一，从中性理论推导分子进化速率的公式，并阐明“完美”分子钟存在的条件。 木村首先从群体遗传学的基本原理出发，区分了个体水平的突变（mutation）和群体水平的替代（substitution）。对于一个给定的基因位点，如果突变是选择中性（selectively neutral）的，那么进化速率（k，单位时间内的替代数）等于中性等位基因的突变率（v）。当以年为时间单位时，进化速率 k1 = v0 / g，其中 v0 是每代的中性突变率，g 是世代时间（以年为单位）。考虑到并非所有突变都是中性的，引入 f0 代表中性突变的比例（即选择性约束的程度），则公式可写为 k1 = f0 * (vt / g)，其中 vt 是每代的总突变率。 由此，木村指出，从中性理论的角度看，一个普遍有效且精确的分子进化钟存在的条件是：对于一个给定的分子，其每年的中性突变率（vt / g）在所有生物体中和所有时间里都保持恒定，并且该分子的选择性约束（f0）也保持不变。任何对这两个条件恒等性的偏离都会使分子钟变得不那么精确。

第二，提出导致分子进化钟不精确的两个主要原因，并发展统计学方法进行检验。 基于上述理论框架，木村明确指出，导致进化速率（k1）变化进而影响分子钟准确性的两个可能原因是：1）每年突变率（vt/g）的改变；2）分子选择性约束（f0）的改变。 * 原因一：每年突变率的变化。这通常是由于世代时间（g）的变化引起的。例如，世代时间短的生物（如啮齿类），其每年的突变率可能更高，从而导致更高的年进化速率。这被称为“世代时间效应”（generation time effect）。 * 原因二：选择性约束的改变。这是由于分子内部环境的变化，例如基因复制（gene duplication）或相互作用分子的改变，导致分子功能重要性（即对有害突变的容忍度）发生变化，从而改变了中性突变的比例 f0。 为了在实际数据中检验不同谱系间进化速率的均匀性，木村在文中开发了一种简单的统计方法。该方法基于一个星状系统发育树（多个谱系从一个共同祖先分化而出），利用各谱系间观察到的氨基酸差异数（经过多重替换校正后），通过最小二乘法估算每个谱系自分化以来累积的氨基酸替换数（xi）。通过计算统计量 r（观察到的替换数方差与理论预期方差之比），可以检验“所有谱系进化速率相同”的零假设。r 值显著大于1，则表明速率不均匀。

第三，应用统计学方法分析血红蛋白和胰岛素数据，实证两大原因在起作用。 木村运用上述方法分析了多个蛋白质的序列数据，以证明其理论推断。 * 血红蛋白α和β链分析：对比人类、小鼠、兔、狗、马、牛六种哺乳动物。分析血红蛋白α链时，r值不显著，表明速率大致均匀。但分析β链时，r值显著，显示出速率差异，特别是小鼠谱系积累了更多替换，而人类谱系较少。当合并α和β链数据后，这种差异变得更为清晰和显著：小鼠的替换数显著高于人类。木村认为，这最有可能是“世代时间效应”的结果：小鼠世代短，每年经历的世代多，因此每年积累的中性突变（从而替代）更多，导致进化速率更快。 * 胰岛素分析：对比包括豚鼠（guinea pig）和河狸鼠（coypu）在内的几种哺乳动物。分析发现，豚鼠和河狸鼠这两种同属于豪猪型亚目（hystricognath）的啮齿类动物，其胰岛素的进化速率异常高，比其他哺乳动物（人、象、羊等）高出一个数量级。然而，对胰岛素原（proinsulin）的C肽（C peptide，在成熟过程中被切除的部分）的分析显示，豚鼠的进化速率与其他动物无异，速率均匀。木村引用并与大田（Ohta）早期的观点一致，认为这提供了一个“选择性约束改变”的典型案例：在豚鼠谱系中，胰岛素分子可能因内部环境剧变（如与锌结合的关键组氨酸位点丢失）而失去了大部分原有功能约束，使得大多数氨基酸变化变得中性（f0大幅增加），从而导致进化速率飙升。而C肽本身功能约束低，在各谱系中f0都高且稳定，因此表现出均匀的速率。

第四，讨论并驳斥基于“速率变化”对中性理论的质疑。 针对当时一些学者（如Ayala, Gillespie）认为观察到的进化速率变异过大，从而否定中性理论的观点，木村进行了有力反驳。 * 对Ayala观点的反驳：Ayala曾分析超氧化物歧化酶（SOD），发现比较的物种亲缘关系越远，估计的进化速率似乎越慢，并认为这证伪了中性理论。木村指出，这种“速率递减”很可能是一种“表观饱和效应”（apparent saturation effect）：随着比较的序列间差异累积越多，通过常规统计方法（如泊松校正）校正多重替换和回复突变会变得越来越困难，导致低估了实际发生的替换数。因此，这并非真正的速率变化，而是方法学上的假象。 * 对Gillespie观点的反驳：Gillespie提出了一个“间断模型”（episodic model），认为分子进化是间断爆发的，由自然选择驱动，并声称该模型预测的速率变异范围（r值）与观察数据吻合。木村批评该模型极不现实，因为它武断地假设所有谱系经历的环境挑战（导致选择事件的“间断”次数）遵循相同的概率分布，而忽略了突变率、种群大小、选择系数等真实生物学参数的影响[如文中公式(6)所示]。木村强调，从中性理论看，观察到的速率变异（r > 1）完全可以由他提出的两个原因（世代时间效应和选择性约束变化）来解释，无需引入特设性的（ad hoc）选择模型。 * 正面例证——RNA病毒：木村还引用RNA病毒（如流感病毒）进化的例子来支持中性理论。RNA病毒具有极高的突变率（因缺乏校对机制），其进化速率也相应地极其高，且呈钟式进化，同时同义替换远多于非同义替换，这是中性进化的典型模式。这强有力地支持了“分子进化速率与突变率成正比”的中性理论核心预测。

第五，总结与展望。 木村在文末总结了从中性理论视角看分子进化钟的本质：其近似恒定源于中性突变率每年的相对恒定。他指出，导致分子钟不精确的主要因素是世代时间效应和选择性约束的改变。他特别强调，分子进化钟并非绝对精确这一事实，绝不构成对中性理论的否定，反而可以在中性理论的框架内得到很好的解释。最后，他呼吁未来应通过实验研究来解决一个关键问题：在世代时间差异巨大的生物中，核苷酸突变率是更恒定于每代（per generation）还是更恒定于每年（per year），这对于深入理解世代时间效应的机制至关重要。

本文的意义与价值： 这篇论文是木村资生捍卫和阐述其中性理论的重要文献之一。它不仅清晰地从第一性原理推导了中性理论下的分子进化速率公式，为理解分子进化钟提供了坚实的理论基础，更重要的是，它积极应对了当时学界对中性理论的挑战。通过将理论预测与实证数据分析相结合，并创造性地发展出检验速率均匀性的统计方法，木村有力地论证了：1）观察到的分子进化速率变异可以用中性理论框架内的合理因素（世代时间、约束变化）来解释；2）这些变异不能作为支持“自然选择驱动分子进化”这一论点的有效证据。论文逻辑严密，论证清晰，深化了人们对分子进化钟现象及其与进化机制关系的理解，巩固了中性理论在解释分子水平进化现象中的核心地位。文中提出的统计方法和分析思路，也对后续的分子系统发育和进化速率研究产生了影响。