学术报告：Cut–dip–budding (CDB) 递送系统实现无需组织培养的植物遗传修饰

一、研究作者及发表信息

本研究的通讯作者为Guofu Li（山东舜丰生物科技有限公司）和Jian-Kang Zhu（南方科技大学生物医学工程学院/中国科学院遗传与发育生物学研究所），第一作者包括Xuesong Cao、Hongtao Xie、Minglei Song等多名贡献者。研究发表于The Innovation期刊，2022年10月25日在线发表，论文标题为《Cut–dip–budding delivery system enables genetic modifications in plants without tissue culture》，DOI: 10.1016/j.xinn.2022.100345。

二、研究背景

植物基因编辑（gene editing）技术在作物改良中潜力巨大，但基因递送系统（gene delivery system）的局限性是主要瓶颈。当前依赖组织培养（tissue culture）的递送方法（如农杆菌介导转化或基因枪法）效率低、成本高，且仅适用于不到0.1%的高等植物（如模式植物或少数作物）。尤其对于木本植物或块根作物（如甘薯），传统方法难以实现稳定遗传转化。

本研究提出一种名为Cut–dip–budding (CDB)的新型递送系统，利用农杆菌根瘤菌（*Agrobacterium rhizogenes*）感染植物外植体（explant），通过诱导转基因根（transformed roots）形成，并利用植物天然的根出条能力（root suckering）直接生成转基因芽体，无需组织培养或无菌条件。研究目标包括：(1) 验证CDB系统在多种植物中的普适性；(2) 实现高效基因编辑；(3) 突破传统方法对基因型的依赖。

三、研究流程与实验设计

1. 实验对象与载体构建

• 植物材料：选取6种代表性植物，包括草本植物（如俄罗斯蒲公英Taraxacum kok-saghyz, TKS）、块根作物（甘薯*Ipomoea batatas*）、木本植物（臭椿*Ailanthus altissima*等）和豆科牧草（冠状岩黄耆*Coronilla varia*）。
  
• 载体设计：使用PCAMBIA1300作为骨架，构建含报告基因（如GFP或Ruby）和基因编辑工具（CRISPR-Cas9）的载体；针对多倍体植物（如甘薯），设计靶向多拷贝基因的双sgRNA系统。
  

2. CDB递送系统的核心步骤

• 外植体处理：切割幼苗茎基部（TKS）或茎尖（甘薯），直接浸染农杆菌K599菌液（非无菌条件）。
  
• 转基因根诱导：外植体接种后培养于蛭石中，2-3周后形成转基因毛状根（hairy roots），通过荧光筛选阳性根。
  
• 芽体再生：将转基因根切段（2-3 cm）置于湿润土壤中，1-4周内形成芽体（无激素处理）。木本植物需额外分段培养（如臭椿），而甘薯块根可直接萌发芽体。
  

3. 基因编辑验证

• 靶基因选择：以八氢番茄红素脱氢酶（PDS）为靶点（编辑后导致白化表型），验证CDB系统的编辑效率。
  
• 多倍体编辑策略：针对甘薯六倍体基因组，设计双sgRNA同时靶向所有同源基因拷贝（图2a）。通过测序（Sanger或TA克隆）分析编辑效率。
  
• 淀粉合成通路编辑：靶向甘薯GBSSI（直链淀粉合成酶）和SBEII（支链淀粉分支酶），通过碘染（iodine staining）和淀粉含量测定验证功能修饰（图S8）。
  

4. 数据分析方法

• 基因组DNA提取（CTAB法）后，通过Tail-PCR鉴定转基因插入位点。
  
• 编辑效率统计：计算不同实验批次中阳性芽体的比例及纯合/杂合编辑类型（图2d, 3m）。
  

四、主要研究结果

1. TKS的遗传转化与编辑：

   • CDB系统在三组独立实验中，40个外植体获得34个转基因根，其中16个生成芽体，13个成功编辑PDS基因，8个为纯合编辑（白化表型）（图2d-e）。
     
   • 通过Ruby报告基因验证了系统的重复性（图S3-S4）。
     

2. 甘薯的高效基因编辑：

   • 10个甘薯品种（包括难转化的紫薯品种Xuzishu8）均实现转化，突破基因型限制（图4a-b）。
     
   • 淀粉合成基因（GBSSI、SBEII）编辑后，直链淀粉含量从27.4%降至3.5%（GBSSI敲除）或升至33.8%（SBEII敲除）（图S8）。
     

3. 木本植物与豆科植物的应用：

   • 首次实现臭椿、辽东楤木和臭牡丹的遗传转化（图5）。豆科植物冠状岩黄耆的转基因芽体荧光验证成功（图5j-k）。
     

五、研究意义与价值

1. 科学价值：

   • CDB系统首次实现无需组织培养的稳定遗传转化，简化流程（非无菌环境、无激素处理），为难以转化的植物提供了通用解决方案。
     
   • 揭示了根出条能力与遗传转化效率的关联，为拓展其他植物应用提供理论基础。
     

2. 应用潜力：

   • 突破果树（如苹果、葡萄）和木本作物（如橡胶树）的转化瓶颈，加速育种进程。
     
   • 甘薯淀粉组成的精准编辑展示其在工业与食品改良中的直接应用价值。
     

六、研究亮点

1. 方法创新性：

   • 首次利用根出条特性绕过组织培养，开发出极简流程（切割-浸染-出芽）。
     
   • 农杆菌根瘤菌（非传统农杆菌）的直接应用，提高转化效率。
     

2. 跨物种普适性：

   • 涵盖草本、木本、块根作物和豆科植物，验证系统广泛适用性。
     

3. 编辑效率突破：

   • 多倍体甘薯的同源基因同步编辑策略（双sgRNA）为复杂基因组作物提供范例。
     

七、其他发现

研究推测，通过调控根出条能力的基因（如发育调节因子WUS/BBM），未来可进一步扩展CDB系统至无根出条特性的植物（如谷物）。