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该研究由G. Desmond Clark-Walker、Philip M. Hansbro、Frank Gibson和Xin Jie Chen完成，其中通讯作者为G. Desmond Clark-Walker，研究单位是澳大利亚国立大学生物科学研究院分子遗传学与进化研究组，以及澳大利亚国立大学约翰·柯廷医学研究院。论文发表于Biochimica et Biophysica Acta（BBA）第1478卷，2000年，页码125–137。

该研究的学术背景集中在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）之间一个长期未解的生物学差异。酿酒酵母可以在完全缺失线粒体DNA（mtDNA）的情况下存活，形成所谓的“petite”突变体，而乳酸克鲁维酵母则属于“petite-negative”酵母，其线粒体DNA的丢失会导致致死性，即“b0-lethality”。已有研究通过筛选抑制b0-lethality的染色体突变，发现这些突变集中于编码F1-ATP酶（F1-ATPase）α、β、γ亚基的ATP1、ATP2和ATP3基因。线粒体F1F0-ATP合酶位于线粒体内膜，在质子从膜间隙流向基质的过程中合成ATP；F1部分由α、β、γ、δ和ε五种亚基组成，其中α和β亚基交替排列形成六聚体，γ亚基位于中央空间。该酶的工作原理已通过牛心线粒体F1的晶体结构得到阐明，其中γ亚基在αβ六聚体内旋转，驱动β亚基催化位点依次发生构象变化。研究的目的在于：第一，通过扩大突变体筛选数量，确定是否还存在其他基因位点参与b0-lethality抑制；第二，在等基因背景下系统研究不同ATP等位基因对表型的影响；第三，利用牛F1晶体结构定位这些可突变氨基酸，以理解抑制作用的分子机制。

研究的工作流程包括多个步骤。首先，研究人员从乳酸克鲁维酵母菌株PM6-7A中分离出35个在16 μg/ml溴化乙锭（ethidium bromide）培养基上生长的自发抑制突变体，这些突变体均缺乏线粒体DNA。随后，为了确定突变所在的基因位点，将突变体与野生型菌株CK56-16C杂交并诱导孢子形成，通过随机孢子分析获得单倍体后代；对不能利用甘油的菌株进行第二轮杂交与孢子形成，以去除可能共分离的pet⁻突变。之后，利用含野生型ATP1、ATP2或ATP3基因的载体转化这些菌株，观察其恢复甘油生长的能力，从而判断突变位点。在确认候选基因后，提取基因组DNA，通过PCR扩增相应等位基因并克隆到测序载体中，利用双脱氧链终止法进行DNA序列测定，以明确碱基替换和氨基酸改变。为了排除其他背景突变的影响，研究构建了等基因菌株：首先通过一步基因置换法分别破坏ATP1、ATP2和ATP3基因，并插入kan⁺抗性模块；随后将野生型或突变型等位基因克隆到整合载体pCXJ4中，并定点整合到leu2位点，以实现单拷贝表达。此外，研究人员还通过体外突变技术构建了ATP2基因的两个特定突变，即T191S和E216K，分别用于增强和消除ATPase活性。为了分析突变对酶功能的影响，研究从不同菌株中分离线粒体，在有无寡霉素（oligomycin）的条件下测定ATPase活性。最后，利用牛心线粒体F1的晶体结构数据，通过序列比对确定乳酸克鲁维酵母中发生突变的氨基酸在牛F1结构中的对应位置，并测量这些残基之间的距离，以分析亚基间相互作用。

研究结果显示，所有35个新分离的抑制突变体均定位于ATP1、ATP2或ATP3基因，未发现新的基因位点。突变集中在少数几个氨基酸位点：ATP1基因中，328位脯氨酸（Pro）变为亮氨酸（Leu）、333位丙氨酸（Ala）变为缬氨酸（Val）或苏氨酸（Thr）、443位苯丙氨酸（Phe）变为丝氨酸（Ser）或亮氨酸（Leu）；ATP2基因中，306位缬氨酸（Val）变为苯丙氨酸（Phe）、435位精氨酸（Arg）可变为甘氨酸（Gly）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）或赖氨酸（Lys）；ATP3基因中，275位苏氨酸（Thr）变为丙氨酸（Ala）、281位异亮氨酸（Ile）变为苏氨酸（Thr）。其中ATP2的435位精氨酸变为甘氨酸出现11次，ATP3的275位苏氨酸变为丙氨酸出现7次，表明这些位点是热点突变。等基因背景下的生长实验表明，不同突变对甘油生长的影响差异很大：ATP1-2、ATP1-3和ATP3-1导致呼吸缺陷，表现为不能利用甘油；ATP2-9和ATP3-2仅能微弱生长；ATP1-1、ATP1-6和ATP2-8的生长弱于野生型；而ATP2 T191S在甘油培养基上的生长与野生型无显著差异。在含溴化乙锭的培养基上，所有抑制突变体均能生长，但ATP2-1生长最好，而ATP1等位基因和ATP2-9的菌落大小不均匀。作为对照，野生型菌株和含ATP2 E216K突变的菌株均不能在溴化乙锭培养基上生长。线粒体ATPase活性测定表明，不同抑制突变体的酶活性可高于或低于相应的野生型：例如，ATP2-8和ATP2-9的ATPase活性分别为5.20和5.92 μmol Pi/min/mg蛋白质，而野生型为3.61；ATP2-1则仅0.74。ATP2 T191S显著提高ATPase活性至7.28，但不具有抑制表型；ATP2 E216K的ATPase活性仅0.41，且无抑制表型。此外，将ATP3-1等位基因引入含ATP2 E216K背景的菌株后，其抑制表型消失，说明抑制b0-lethality需要F1的ATPase活性。结构分析显示，这七个可突变氨基酸在牛F1结构中分布于两个区域：一个位于靠近线粒体膜的F1底部，另一个位于靠近基质的顶部区域。在上部区域，γ亚基的259位苏氨酸和265位异亮氨酸分别与β亚基的279位缬氨酸和α亚基的293位丙氨酸距离很近；α亚基的288位脯氨酸也与γ亚基的271位丙氨酸相邻。在下部区域，β亚基的408位精氨酸与α亚基的403位苯丙氨酸在ADP结合构象中非常接近，精氨酸末端氨基与苯丙氨酸芳香环之间可能存在氨基-芳香相互作用；此外，β亚基的406位苯丙氨酸与α亚基的403位苯丙氨酸也可能形成芳香-芳香相互作用。这些结果表明，所有可突变残基都位于亚基接触界面附近，突变可能通过改变亚基间相互作用而影响F1的性质。

研究的结论指出，抑制b0-lethality的突变仅发生在F1-ATP酶的α、β和γ亚基中，并且这些突变改变了亚基间的接触。虽然ATPase活性对于抑制作用是必需的，但单独的ATPase活性水平并不能直接预测抑制表型；相反，突变所赋予的额外功能尚未被现有检测方法所捕获。作者提出，抑制突变可能通过改变F1的性质，使其在缺乏F0的情况下仍能有效水解ATP，提供ADP用于腺嘌呤核苷酸转运体（ADP/ATP translocase）进行电致交换，从而维持线粒体内膜电位（Δψ）和细胞存活。这一假说与哺乳动物ρ⁰细胞中F1对维持线粒体膜电位和存活的重要性相一致。该研究的科学价值在于，它将遗传筛选、等基因表型分析和结构生物学方法结合起来，将b0-lethality抑制现象定位于F1-ATP酶亚基间相互作用的变化，为理解线粒体DNA缺失致死性及F1在细胞能量代谢中的非经典功能提供了重要线索。此外，研究还揭示了乳酸克鲁维酵母与酿酒酵母中ATP3突变位点的相似性，提示不同遗传筛选可能通过相同机制抑制不同表型。

本研究的亮点包括：首次在等基因背景下系统比较了不同ATP突变等位基因的生长和酶活性特征，排除了背景突变的干扰；将酵母中抑制突变对应到牛F1的高分辨率晶体结构上，揭示了突变位点的空间关系；并提出了通过改变F1亚基相互作用来维持线粒体膜电位的可能机制，为后续研究提供了可验证的假说。