本研究由Ying Wang、Di-Feng Zhan、Hui-Liang Li、Dong Guo、Jia-Hong Zhu及Shi-Qing Peng等人完成，主要作者隶属于中国热带农业科学院热带生物技术研究所（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences）和海南大学热带作物学院（Institute of Tropical Crops, Hainan University）。该研究发表于 *Scientific Reports*，文章于2018年8月20日投稿，2019年8月16日接收，最终发表于2019年第9卷，文章编号12673。

巴西橡胶树（*Hevea brasiliensis*）是天然橡胶（natural rubber, NR）的主要商业来源。天然橡胶是一种顺式-1,4-聚异戊二烯生物聚合物，其生物合成发生在橡胶树乳管细胞（laticifer cells）中的橡胶粒子表面。天然橡胶的生物合成途径在代谢层面已经较为清楚，但其分子调控机制仍不明确。MADS-box转录因子在植物生长发育、花器官形态建成、开花时间调控、胚胎发育及果实成熟等过程中发挥重要作用，但关于MADS-box基因参与次生代谢产物调控的报道非常少。此前仅有少数巴西橡胶树MADS-box基因被鉴定，其中HbMADS4被报道负调控参与天然橡胶生物合成的*HbSRPP*基因。为了系统揭示巴西橡胶树乳管细胞中高表达的MADS-box基因家族及其在天然橡胶生物合成调控中的潜在功能，作者开展了本研究。研究的主要目标是：从橡胶树胶乳转录组中鉴定MADS-box基因家族成员，分析其系统进化、基因结构、保守基序、组织表达模式及激素响应，并进一步解析其中一个基因*HbLMADS24*对天然橡胶合成关键酶基因*HbFPS1*启动子的调控作用。

在研究流程方面，作者首先利用本实验室前期通过Illumina HiSeq 2000技术获得的巴西橡胶树胶乳转录组数据库，从中筛选出36个MADS-box unigenes，然后以这些unigenes为查询序列，在本地巴西橡胶树基因组数据库中进行BLAST比对，最终确认了24个MADS-box基因，并将其命名为*HbLMADS1*至*HbLMADS24*。对这些基因的编码区序列长度、氨基酸数目、预测分子量和等电点等基本性质进行了分析。其次，作者利用拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）和水稻（*Oryza sativa*）已知的MADS-box蛋白序列，通过邻接法（neighbor-joining method）构建系统发育树，将24个巴西橡胶树MADS-box基因分为I型和II型两大类。其中4个I型基因进一步分为Mα（3个）和Mβ（1个）亚组，20个II型基因分为MIKC*（8个）和MIKCC（12个）亚组，MIKCC基因又进一步归入SOC1、AGL17、SVP、AP1和FLC五个亚家族。第三，作者利用在线软件GSDS分析了这些基因的外显子-内含子结构，发现II型基因具有7至11个外显子，而I型基因仅含1个外显子，说明II型基因结构更复杂。利用MEME工具鉴定了24个HbLMADS蛋白的保守基序，共发现17个保守基序，其中motif 1是所有蛋白共有的MADS结构域，motif 3代表K结构域，仅存在于II型蛋白中。第四，作者通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了24个MADS-box基因在根、树皮、叶、花和胶乳五种组织中的表达模式。结果显示8个基因（*HbLMADS3、5、6、7、9、13、23、24*）在胶乳中高表达，8个基因在花中高表达，8个基因在叶中高表达，所有基因在根中几乎不表达，在树皮中表达较低。第五，针对在胶乳中高表达的4个尚未报道的基因（*HbLMADS3、5、9、24*），作者进一步分析了它们在外源激素处理下的表达变化。结果表明，茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）处理上调了*HbLMADS3、HbLMADS5*和*HbLMADS24*的表达；脱落酸（abscisic acid, ABA）处理在12小时显著上调*HbLMADS9*的表达；水杨酸（salicylic acid, SA）处理对*HbLMADS9*和*HbLMADS24*仅轻微上调；乙烯利（ethrel, ET）处理对这4个基因表达无明显影响。第六，作者选择*HbLMADS24*进行功能研究。亚细胞定位实验显示HbLMADS24-GFP融合蛋白定位于洋葱表皮细胞核中，而对照GFP蛋白分布于细胞质。第七，作者利用酵母单杂交实验验证HbLMADS24是否结合*HbFPS1*启动子。结果显示，共转化pGAD-HbLMADS24和pHIS-pHbFPS1的酵母可在含有70 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的三缺培养基（SD/-Trp/-His/-Leu）上生长，表明HbLMADS24能在酵母中结合*HbFPS1*启动子。第八，作者通过烟草叶片瞬时双荧光素酶（dual-luciferase）实验进一步验证HbLMADS24对*HbFPS1*启动子的激活作用。结果发现，单独转化*HbFPS1*启动子驱动的荧光素酶表达较弱，而共表达HbLMADS24后荧光素酶活性显著升高，说明HbLMADS24能够激活*HbFPS1*启动子的表达。

在主要结果方面，该研究首次在巴西橡胶树胶乳转录组中系统鉴定了24个MADS-box基因家族成员，并明确了其分类归属。基因结构分析表明II型基因具有更多外显子，结构更复杂，这与在拟南芥、大白菜、苹果和梅等植物中的研究结果一致，提示II型MADS-box基因可能具有更多样和复杂的功能。保守基序分析证实所有HbLMADS蛋白均含有MADS结构域，II型蛋白还含有K结构域。组织表达分析显示不同亚家族的MADS-box基因具有明显的组织特异性。MIKC*型基因主要在花中高表达，这与拟南芥和水稻中的报道一致；MIKCC型基因在叶和胶乳中高表达；I型基因表现出多样化的表达特征，如*HbLMADS24*在胶乳中高表达，*HbLMADS22*在花中特异表达，*HbLMADS10*和*HbLMADS21*在叶中高表达，说明这些基因可能具有多重功能。激素响应实验表明，JA信号和ABA信号可能通过调控特定MADS-box基因的表达参与天然橡胶生物合成的调控。MeJA上调*HbLMADS3、5、24*的表达，提示这些基因可能在JA信号通路中发挥作用。ABA上调*HbLMADS9*的表达，表明*HbLMADS9*可能参与ABA信号调控的天然橡胶合成。功能研究揭示了*HbLMADS24*作为一个I型MADS-box基因，能够结合并激活*HbFPS1*启动子，而*HbFPS1*是天然橡胶生物合成途径中的重要酶基因。这一发现表明*HbLMADS24*可能作为*HbFPS1*的转录激活因子参与天然橡胶生物合成的调控。这是首次报道I型MADS-box基因参与次生代谢调控，为深入理解天然橡胶生物合成的分子调控网络提供了新的线索。

本研究的结论是：从巴西橡胶树胶乳中系统鉴定了24个MADS-box基因，其中8个在乳管细胞中优势表达；*HbLMADS24*编码一个定位于细胞核的转录因子，能够结合*HbFPS1*启动子并在植物细胞中激活其表达，可能通过调控*HbFPS1*参与天然橡胶生物合成。该研究的科学价值在于揭示了MADS-box转录因子在橡胶树次生代谢调控中的潜在功能，尤其是I型MADS-box基因参与天然橡胶合成调控的新机制；应用价值在于为通过基因工程手段提高橡胶树天然橡胶产量提供了候选基因和调控靶点。研究亮点包括：首次在橡胶树胶乳中系统分析MADS-box基因家族，发现8个乳管细胞高表达基因，并鉴定出*HbLMADS24*作为*HbFPS1*的正调控转录因子，同时揭示了JA和ABA信号可能通过MADS-box基因参与天然橡胶生物合成调控。此外，该研究还提供了详细的基因结构、保守基序和表达模式数据，为后续研究巴西橡胶树MADS-box基因家族的功能演化及调控网络奠定了基础。