Khalil Mimouni、Weiqi Qiu 和 Huiqing Zhou 等研究者（来自 Boston College 化学系）在 Biochemistry 期刊上发表了一项研究，开发了一种基于荧光 RNA 适配体（fluorogenic RNA aptamer）的 T7 RNA 聚合酶（T7 RNA polymerase, T7 RNAP）活性定量方法。该研究发表于 2026 年，旨在解决传统 T7 RNAP 活性单位测定依赖放射性标记所带来的安全性和可及性问题。T7 RNAP 是分子生物学和 RNA 治疗产业中的核心工具酶，广泛用于体外转录（in vitro transcription, IVT）、合成生物学、CRISPR 向导 RNA 制备以及 mRNA 药物生产。传统上，T7 RNAP 的活性单位通过放射性同位素（如 ³H 或 ³²P）标记核苷酸掺入实验来定量，但该方法不仅对实验室条件和人员安全要求高，而且许多生化实验室难以常规开展。因此，该研究团队提出了一种利用 Broccoli RNA 适配体作为转录报告子的荧光检测方法，通过将 RNA 合成与荧光信号偶联，实现了对 T7 RNAP 活性单位的简便、定量且无放射性的测定。

该研究的核心思路是：在体外转录反应中，使用含有 T7 启动子和 Broccoli 适配体编码序列的双链 DNA 模板。当 T7 RNAP 转录产生 Broccoli RNA 后，该 RNA 会与小分子染料 DFHBI-1T 结合并发出荧光。因此，荧光信号的增强速率可以反映 RNA 的合成速率，进而与 T7 RNAP 的活性单位建立定量关系。研究采用了商业化 NEB T7 RNAP 作为标准参照，建立了一条荧光初始速率与酶活性单位之间的线性校准曲线，并进一步将该方法用于评估来自不同来源和不同批次纯化的 T7 RNAP 活性。

在实验流程方面，研究主要分为几个步骤。首先，研究团队通过 PCR 扩增制备了包含 T7 启动子和 Broccoli 适配体序列的双链 DNA 模板，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化。其次，他们建立并优化了 Broccoli IVT 反应体系。该反应在 40 mM Tris-HCl（pH 7.9）、31 mM MgCl₂、11 mM DTT、2 mM 亚精胺、2 mM 各 NTP、50 μM DFHBI-1T 和 0.25% DMSO 的条件下进行。之所以额外添加较高浓度的 Mg²⁺，是因为 Broccoli RNA 的正确折叠依赖于 Mg²⁺ 结合。随后，他们在 384 孔板中使用酶标仪在 37 °C 下连续监测荧光信号（激发波长 472 nm，发射波长 507 nm）60 分钟。为了定量 T7 RNAP 活性，研究团队从荧光响应曲线的早期近线性阶段提取了“观察到的初始速率”（observed initial rate），该速率是通过滑动时间窗线性回归并选择拟合优度最高的区间获得的。他们发现，在 1.25 至 10 U/μL 的范围内，不同活性单位的 NEB T7 RNAP 所产生的荧光初始速率与酶活性单位呈现出显著的线性相关（Pearson’s r = 0.97），从而建立了一条校正曲线（y = 20.26x + 35.50）。为了验证该校正曲线的可靠性，研究团队设置了 2、5 和 8 U/μL 三个未知浓度的验证组，通过校正曲线计算得到的测量活性分别为 1.9 ± 0.8、4.7 ± 0.8 和 7 ± 2 U/μL，与预期活性相符。

在方法建立之后，研究团队将该方法应用于不同来源 T7 RNAP 的活性评估。他们比较了 NEB 酶、Thermo Scientific 商业化酶以及两个批次的自制 T7 RNAP（in-house-1 和 in-house-2）。由于 NEB 酶的浓度低于传统 UV 吸光度和 Bradford 法的检测限，研究采用了 Qubit 高灵敏度蛋白定量法，测得 NEB 酶浓度为 259 ng/μL，Thermo Scientific 酶为 242 ng/μL，而两个自制酶的浓度分别为 1638 ng/μL 和 1852 ng/μL。在相同摩尔浓度（0.13 μM）下进行 Broccoli IVT 反应后，利用校正曲线计算出 Thermo Scientific、in-house-1 和 in-house-2 的活性分别为 1.6 ± 0.6、2.5 ± 0.8 和 7 ± 2 U/μL。进一步换算为比活性（U/ng）后发现，in-house-2 酶具有最高的比活性，而其他三种酶的比活性相当。SDS-PAGE 分析显示四种酶的纯度均较高，但两个自制酶存在少量杂质带，可能与仅采用一步 Ni 亲和层析有关。该结果表明，Broccoli IVT 方法能够有效揭示不同来源或不同批次 T7 RNAP 之间比活性的差异，有助于实验室间和批次间的一致性评估。

为了进一步验证该方法在 RNA 制备应用中的实用性，研究团队在归一化酶活性单位的条件下，分别使用 Thermo Scientific、in-house-1 和 in-house-2 酶对两种结构不同的 RNA 转录本进行了制备级 IVT。其中，Broccoli RNA 在 Broccoli IVT 条件下转录约 20 分钟，而 tRNAᴳˡʸ 样转录本则在标准 T7 反应条件下转录 3 小时。通过 8 M 尿素变性 PAGE 和 SYBR Gold 染色分析发现，在 5 U/μL 的相同活性单位下，Thermo Scientific 和 in-house-2 酶产生的 Broccoli RNA 产量相当，而 in-house-1 酶产量略低，这可能是由于微量 RNase 污染。在标准 IVT 条件下，三种酶产生的 tRNAᴳˡʸ 样 RNA 产量则基本一致。这些结果说明，通过 Broccoli IVT 方法测定的活性单位可以用于标定制备级 IVT 反应的酶量，从而实现不同来源 T7 RNAP 之间 RNA 产量的可比性。

该研究的结论指出，Broccoli IVT 方法提供了一种低成本、简便且无放射性的 T7 RNAP 活性定量工具。与传统的放射性标记法、比色法以及“broken beacon” 荧光探针法相比，该方法不需要修饰寡核苷酸或细胞提取物等复杂组分，仅需商业化的 T7 RNAP 作为参照和 DFHBI-1T 染料，即可在常规生化实验室中实现活性单位的测定。该方法不能独立定义活性单位，而是以商业化参照酶的单位定义为基准进行定量。研究还发现，过期或储存不当的酶活性会显著下降，因此建议在建立校正曲线时使用新鲜的商业化 T7 RNAP。此外，该方法有望通过将 T7 启动子替换为 SP6 启动子而拓展至 SP6 RNAP 的活性测定。

本研究的主要亮点包括：第一，利用 Broccoli RNA 适配体与 DFHBI-1T 的荧光生成特性，将 RNA 合成过程与荧光信号实时偶联，实现了单步、实时、无放射性的活性检测。第二，采用荧光响应曲线的初始速率而非某一时间点的荧光强度作为定量指标，更准确地反映了酶促反应初期的 RNA 合成速率，并与传统的活性单位定义之间建立了线性关系。第三，该方法可广泛适用于不同来源、不同批次 T7 RNAP 的活性比较和归一化，有助于提高分子生物学实验和 RNA 制备过程中的一致性和可重复性。该研究为 RNA 聚合酶活性评估提供了一种实用且易于推广的技术方案，对于基础研究和 RNA 治疗产业化中的质量控制均具有重要的应用价值。