本研究由Laura A. Sznyter、Barton Slatko、Laurie Moran、Kimberly H. O’Donnell及Joan E. Brooks等人完成，其中Kimberly H. O’Donnell的当时通讯地址为Brandeis University生物化学系，其余作者均来自New England Biolabs公司。该研究于1987年7月20日投稿，1987年9月21日修订并接收，发表在《Nucleic Acids Research》第15卷第20期，登录号为Y00449。
该研究属于原核生物限制修饰系统（restriction-modification system）的分子生物学领域。限制修饰系统广泛存在于原核生物中，通过限制性内切酶（restriction endonuclease）识别并切割外来DNA，同时依靠同源的DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，即甲基化酶）修饰自身DNA，以保护宿主免受噬菌体或外源质粒的入侵。DdeI限制修饰系统来源于脱硫弧菌挪威株（Desulfovibrio desulfuricans Norway），此前已被克隆并在大肠杆菌中以两个相容质粒分别维持。然而，该系统的克隆面临特殊困难：只有携带截短形式甲基化酶基因的克隆才能支持完整内切酶基因的稳定维持，而包含完整甲基化酶基因的克隆却无法支持内切酶活性。这一异常现象促使研究者对DdeI系统的核苷酸序列进行测定，并对其甲基化酶蛋白进行生化比较，以期揭示甲基化酶表达水平差异的分子基础，同时加深对限制修饰系统基因结构与调控的认识。
研究首先对包含DdeI限制修饰系统的2256个碱基对区域进行了DNA序列测定。测序策略采用双脱氧链终止法，使用双链DNA模板，结合pBR322和pUC19亚克隆、通用引物以及根据已获得序列人工合成的寡核苷酸内部引物，对两条链均进行了覆盖。序列分析显示该区域仅有两个足够大的开放阅读框（open reading frame）。第一个开放阅读框起始于第138位的ATG，终止于第858位的TAG，编码240个氨基酸的多肽，预测分子量为27,808道尔顿，该开放阅读框被鉴定为DdeI内切酶基因（r基因）。由核苷酸序列推导出的前19个氨基酸与此前通过蛋白质氨基端测序获得的内切酶氨基端序列完全一致，且预测分子量与纯化内切酶在SDS-PAGE上的结果相符。第二个开放阅读框位于内切酶基因下游6个碱基处，从第864位的ATG开始，终止于第2109位的TAA，全长1245个碱基对。若以第一个ATG为起始，编码415个氨基酸的蛋白质，预测分子量为47,081道尔顿；若以54个碱基下游的第918位第二个ATG为起始，则编码388个氨基酸的蛋白质，分子量为43,736道尔顿。由于纯化甲基化酶氨基端测序未成功，无法直接确定翻译起始位点。但Bal-31缺失实验显示，缺失末端位于第864位之前的克隆仍保留甲基化酶活性，而缺失末端位于第909位的克隆则完全丧失甲基化酶活性，因此研究者倾向于认为第一个ATG是甲基化酶基因的真正起始位点。序列分析还发现，在内切酶基因上游约第69位存在与大肠杆菌启动子共有序列高度同源的区域，可能是r基因的启动子，但甲基化酶基因上游未发现类似启动子序列，提示两个基因可能以操纵子形式共同转录。两个基因的假定翻译起始位点均具有较合理的Shine-Dalgarno序列。编码区GC含量为37%，明显低于脱硫弧菌基因组整体57%的GC含量。此外，在DdeI编码区及其邻近区域未发现DdeI识别位点（5’-CTNAG-3’）。
在序列分析基础上，研究者发现此前构建的“高活性”甲基化酶亚克隆pDdeM1.6实际上编码的是截短形式的甲基化酶M.DdeI’。该截短蛋白缺失了完整甲基化酶羧基端最后33个高度带电的氨基酸，并被来自pBR322的6个氨基酸所替代。为比较截短型与完整型甲基化酶的功能差异，研究者利用EcoRI和SacI双酶切、Klenow片段补平和T4 DNA连接酶连接的方法，构建了含有完整甲基化酶开放阅读框的质粒pDdeM2.0。将携带完整内切酶基因的质粒pDdeR2.3分别转化到含pDdeM2.0或pDdeM1.6的细胞中后发现，只有含pDdeM1.6的细胞表现出DdeI内切酶活性。含pDdeM2.0的细胞在转化初期仅有极低水平的内切酶表达，随后内切酶基因被细胞灭活，并且pDdeR2.3质粒发生重排，产生多种额外片段。这一结果明确表明，完整甲基化酶在体内无法提供足够的保护以维持内切酶基因的稳定存在。
为探究甲基化酶基因在pBR322中的表达是否受插入方向及旁侧序列影响，研究者对pDdeM3.0a和pDdeM3.0b进行了一系列Bal-31核酸酶缺失实验。结果显示，去除四环素启动子对甲基化酶活性无显著影响；缺失甲基化酶基因上游部分内切酶基因序列会轻微提高甲基化酶表达；缺失甲基化酶基因远端序列也会增加甲基化酶活性。然而，与插入方向相比，这些效应均较小：“a”方向的甲基化酶活性始终高于“b”方向。研究者推测，方向依赖性的表达差异可能与消除脱硫弧菌DNA中的抑制性二级结构或缩短与pBR322中启动子序列的距离有关。但无论在何种方向或缺失情况下，只有含截短甲基化酶基因的pDdeM1.6才能产生足够高的甲基化酶活性，以完全保护λ噬菌体DNA并支持内切酶活性。即使将含完整甲基化酶基因的2.0 kb HindIII-SacI片段克隆到高拷贝且带lac启动子的pUC18载体中，其甲基化酶活性仍低于pDdeM1.6，且不足以支持内切酶活性。
为区分甲基化酶表达水平与蛋白质自身性质的差异，研究者分别从含pDdeM1.6和pDdeM2.0的细胞中纯化了截短型与完整型甲基化酶。截短型M.DdeI’经肝素-琼脂糖凝胶（heparin-sepharose）、Mono Q阴离子交换和Poly CAT A阳离子交换三步柱层析纯化后，可达到约90%的均一性。纯化的M.DdeI’在SDS-PAGE上显示单一主带，表观分子量约为43,000道尔顿，与根据核苷酸序列预测的分子量一致。但M.DdeI’的纯化产率较低，仅约1%，纯化后比活为8,000单位/毫克。该蛋白在储存时活性迅速下降，-20°C保存一个月后活性丧失超过80%。完整型M.DdeI的纯化更为困难：使用与M.DdeI’纯化等量的细胞起始时，第二步柱层析后即丧失全部甲基化酶活性；即使使用20倍细胞量，第三步柱层析后也无法回收到活性。在粗提物阶段，即使用20倍于M.DdeI’所需的提取物量，M.DdeI仍不能完全保护1微克线性化pBR322免受DdeI内切酶切割。为排除截短蛋白丧失特异性而修饰非经典位点的可能，研究者进行了两种特异性检测。在饱和条件下，以pBR322为底物时，M.DdeI’每识别位点掺入约1.5×10⁻⁷摩尔甲基基团，与其他已知甲基化酶（如M.PstI、M.TaqI、M.EcoRI和M.AluI）的水平相当；而M.DdeI仅达到约0.9×10⁻⁷摩尔/位点，约为60%掺入。当以预先被DdeI内切酶完全消化的pBR322为底物时，两种甲基化酶均不能掺入显著量的放射性甲基基团。这些结果表明，M.DdeI’并未丧失特异性，而是比完整M.DdeI具有更高的活性和稳定性。
通过计算机程序COMPARE/DOTPLOT和ALIGN，研究者将推导出的M.DdeI氨基酸序列与其他已知的胞嘧啶甲基化酶进行了同源性比较。结果显示，M.DdeI与M.BsuRI、M.Spr、M.HhaI、M.EcoRII等胞嘧啶甲基化酶之间存在六个明显的同源区域（A至F），其中四个区域（A至D）位于氨基端，两个区域（E和F）位于羧基端。在所有比较的胞嘧啶甲基化酶中，区域D与区域E之间均存在一个较大的非同源区域。已有证据表明，在Spr系统中，该非同源区域可能负责序列识别。M.DdeI与M.HaeIII之间具有稍高程度的同源性。此外，M.DdeI与腺嘌呤甲基化酶之间未发现显著同源性，内切酶R.DdeI与已知内切酶之间也无同源性。在M.DdeI羧基端第382至第415位氨基酸区域与其他甲基化酶无同源性，该区域恰好是在M.DdeI’中被截去的部分。类似情况也见于M.EcoRII，其氨基端34个氨基酸缺失后蛋白仍保持甲基化酶活性。
综合以上结果，本研究的结论是：DdeI限制修饰系统在染色体上以内切酶基因在前、甲基化酶基因在后的顺序排列，两者同向转录，其基因组排列方式与EcoRI和BsuRI系统类似。DdeI系统之所以难以在大肠杆菌中一步克隆完整系统，核心问题在于完整甲基化酶M.DdeI在体内和体外均表现出低活性和不稳定性，而截短型M.DdeI’虽然丢失了羧基端33个氨基酸，却具有更高的活性和稳定性，能够提供足够的甲基化保护以维持内切酶基因的存在。同源性分析进一步表明，M.DdeI属于胞嘧啶甲基化酶家族，其保守区域可能参与辅因子结合或催化功能，而序列识别区则位于非同源区域。
该研究的科学价值在于：首次从核苷酸和蛋白质水平解释了DdeI限制修饰系统克隆困难的原因，揭示了甲基化酶羧基端结构域对酶活性和稳定性的重要影响，为理解限制修饰系统在大肠杆菌中异源表达的调控提供了新证据。此外，胞嘧啶甲基化酶之间保守区域的鉴定进一步支持了该类酶具有共同进化起源的观点，而非保守区域与序列识别功能相关的推测也为后续甲基化酶结构与功能研究提供了重要线索。在应用层面，该研究展示了通过截短改造提高甲基化酶表达水平以支持限制修饰系统在异源宿主中稳定维持的策略，对于其他难以克隆的限制修饰系统具有借鉴意义。该研究的亮点包括：确定了DdeI系统2256个碱基对的完整核苷酸序列并推导出两个蛋白质的氨基酸序列；发现“高活性”甲基化酶克隆实际上编码截短蛋白，并证明该截短型蛋白比完整蛋白更稳定且活性更高；通过Bal-31缺失实验阐明了插入方向对甲基化酶表达的影响；系统比较了M.DdeI与其他胞嘧啶甲基化酶的保守区域，为后续功能域分析奠定了基础。此外，研究者还指出，DdeI克隆并非完全稳定，长期保存会导致细胞死亡，因此他们仍继续努力解决DdeI克隆中存在的问题，并利用所获得的信息克隆其他难以处理的限制修饰系统。