RNA二级结构动态调控翻译起始位点选择的机制研究

作者与发表信息

本研究由Yezi Xiang（杜克大学）、Wenze Huang（清华大学）、Lianmei Tan（杜克大学医学中心）等共同完成，通讯作者为杜克大学的Xinnian Dong。研究成果于2023年9月14日发表在*Nature*期刊（Volume 621, pp. 423–430），标题为“Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection”。

学术背景

研究领域与背景知识

本研究属于翻译调控（translational control）领域，聚焦于上游开放阅读框（uORFs, upstream open reading frames）对真核生物mRNA翻译的调控机制。uORFs广泛存在于真核生物mRNA的5′非翻译区（5′ UTR），其起始密码子（uAUGs）可通过竞争核糖体抑制下游主开放阅读框（mORF）的翻译。然而，uAUGs在不同条件下选择性启动翻译的机制尚不明确。

研究动机与目标

植物在免疫应答（如模式触发免疫PTI）中需快速调整蛋白质翻译。已知uORFs可抑制防御蛋白的翻译，但病原体感染后如何解除这种抑制仍不清楚。本研究旨在揭示uAUG下游RNA二级结构（uAUG-ds）如何动态调控翻译起始位点的选择，并探索其跨物种保守性。

研究方法与流程

1. 全局翻译组与结构组分析

研究对象：拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）幼苗，经细菌衍生肽elf18处理（模拟PTI）或mock对照。
实验设计：
- Ribo-seq（核糖体足迹测序）：鉴定翻译效率变化的转录本（TE-up、TE-down、TE-nc组），分析uAUGs的核糖体占用率。
- SHAPE-MaP（RNA结构探测）：使用2-甲基烟酸咪唑酯（NAI）标记单链RNA，通过突变谱分析体内RNA二级结构动态。
关键发现：
- TE-up转录本富含uORFs，且在mock条件下uAUGs的翻译活性更高（图1c）。
- uAUGs下游存在稳定的双链RNA结构（uAUG-ds），其解旋与免疫诱导的翻译重编程相关（图2b–d）。

2. 深度学习模型TISNet的开发

方法创新：
- 结合序列与SHAPE-MaP结构数据，训练深度神经网络（TISNet）预测翻译起始位点。
- 验证uAUG-ds的特征：茎环结构（12–20 bp，自由能–19.9至–34.1 kcal/mol），富含GC对及UCU/UUC环序列（图2e–g）。
结果：TISNet准确区分翻译起始与非起始AUGs（AUC=0.89），证实uAUG-ds是翻译起始的关键决定因素。

3. 功能验证实验

植物系统：
- 双荧光素酶报告系统：在烟草（*Nicotiana benthamiana*）中验证uAUG-ds的调控功能。例如，破坏*TBF1*基因的uAUG2-ds结构（突变茎环）可显著增强下游荧光素酶表达（图3c）。
- 合成报告基因：设计人工uAUG-ds，证实其抑制mORF翻译的通用性（图3d）。
人类细胞：
- 在HEK293FT细胞中，哺乳动物*ATF4*和*BRCA1*的uAUG-ds同样调控翻译起始（图3e–g），表明机制跨物种保守。

4. RNA解旋酶的调控作用

发现：拟南芥中，免疫诱导的RNA解旋酶（RH37、RH11、RH52，与酵母Ded1p和人类DDX3X同源）表达上调。
功能验证：
- 过表达RH37/YFP可解除uAUG-ds对*TBF1*翻译的抑制（图4c）。
- CRISPR敲除*RH37/RH52*双突变体削弱elf18诱导的uAUG-ds解旋及防御蛋白翻译（图4e）。
表型分析：解旋酶突变体降低植物对病原体*Pseudomonas syringae*的抗性（图4f）。

主要研究结果

1. uAUG-ds的普遍性与功能：

   • 在拟南芥中，30%的免疫诱导转录本（TE-up）具有高翻译活性的uAUGs，其下游存在保守的茎环结构（uAUG-ds）。
     
   • 结构分析显示，uAUG-ds通过减缓预起始复合体（43S PIC）的扫描，促进uAUGs的翻译起始（图2h）。
     

2. 动态调控机制：

   • 免疫刺激后，RNA解旋酶（如RH37）被诱导表达，解旋uAUG-ds，使核糖体绕过uAUGs起始下游mORF翻译（图4g）。
     
   • SHAPE-MaP数据显示，elf18处理显著增加uAUG下游区域的单链性（图3a–b）。
     

3. 跨物种保守性：

   • 人类细胞中，*ATF4*和*BRCA1*的uAUG-ds同样调控翻译，且人工设计的uAUG-ds在植物和人类细胞中均有效（图3d–f）。
     

研究结论与意义

科学价值

1. 机制创新：首次揭示RNA二级结构（uAUG-ds）动态调控翻译起始位点选择的普适机制，突破了传统Kozak序列决定翻译起始的认知局限。
   
2. 跨物种保守性：uAUG-ds与解旋酶的调控模块在植物和人类中保守，为真核生物翻译重编程提供了统一理论框架。
   

应用潜力

1. 合成生物学：基于uAUG-ds的理性设计可用于可控蛋白表达系统（如植物抗病基因工程）。
   
2. 疾病治疗：人类基因（如*BRCA1*）的uAUG-ds突变可能导致翻译异常，或成为癌症治疗的靶点。
   

研究亮点

1. 多组学整合：结合Ribo-seq、SHAPE-MaP和深度学习，系统性解析RNA结构与翻译的关系。
   
2. 方法创新：开发TISNet模型，首次实现基于序列与结构的翻译起始位点预测。
   
3. 动态视角：揭示应激条件下RNA解旋酶介导的结构重塑如何快速重编程翻译。
   

其他有价值的内容

• 技术细节：SHAPE-MaP在植物中的优化应用（Extended Data Fig. 3），为植物RNA结构研究提供新工具。
  
• 进化意义：uAUG-ds可能通过正达尔文选择（positive Darwinian selection）保留，但其序列不保守，提示功能通过结构而非序列实现（引言部分）。