关于玉米光敏色素C调控开花时间和株高功能研究的学术报告

本研究由来自中国多所顶尖农业研究机构的科研团队合作完成。主要作者包括Quanquan Li（山东农业大学）、Guangxia Wu（中国农业科学院生物技术研究所）、Yongping Zhao、Baobao Wang、Binbin Zhao（中国农业科学院生物技术研究所）、Dexin Kong、Hongbin Wei（华南农业大学）、Cuixia Chen（山东农业大学，通讯作者）以及Haiyang Wang（华南农业大学，通讯作者）。该项研究成果于2020年4月20日被接受，并发表在Plant Biotechnology Journal期刊上（2020年，第18卷，第2520-2532页）。

一、 研究的学术背景

本研究隶属于植物分子生物学与作物遗传改良领域，具体聚焦于植物光信号传导与作物重要性状调控的交叉研究。

随着全球人口增长和耕地资源紧张，提高单位面积产量成为保障粮食安全的关键。增加种植密度是提高玉米等主要作物产量的有效策略之一。然而，在高密度种植条件下，植株间相互遮荫会导致冠层内红光与远红光比例（R:FR）下降。植物通过其光受体（主要是光敏色素）感知到这种“遮荫信号”后，会触发一系列适应性反应，即避荫综合症（Shade-Avoidance Syndrome, SAS）。SAS在拟南芥等模式植物中被广泛研究，其典型特征包括茎秆过度伸长（易倒伏）、开花时间改变、花器官发育异常等，这些反应对玉米在高密度下的产量构成严重威胁，例如增加植株和穗位高度、延长吐丝-散粉间隔、削弱茎秆抗倒伏能力等。

光敏色素是感知红光和远红光的主要受体。在拟南芥中，光敏色素家族有五个成员（PhyA-PhyE），其中PhyB在介导低辐照度反应（LFR）和抑制SAS中起主导作用，而PhyC的功能研究相对较少，已知其在拟南芥中作为弱红光传感器，并在短日条件下抑制开花。玉米基因组包含两套复制的光敏色素基因，分别为*phyA1/A2*、*phyB1/B2*和*phyC1/C2*。此前研究显示，玉米的*phyB1 phyB2*双突变体表现出节间伸长和易倒伏的表型，而过表达*phyA1*则会增加株高和穗位高。然而，关于玉米中两个PhyC同源基因——*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*——在调控玉米发育、开花时间及避荫反应中的具体功能，尚未有报道。

因此，本研究旨在系统解析*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*的基因表达模式、分子特性及其在玉米生长发育中的生物学功能，特别是它们对开花时间和株高/穗位高的调控作用。其最终目标是为通过分子育种手段培育耐密植、抗倒伏、适应性广的玉米新品种提供理论依据和潜在的基因靶点。

二、 详细的研究流程

本研究采用了多层次的综合研究策略，从分子特性分析、异源功能互补到玉米自身遗传转化和表型鉴定，流程严谨且系统。主要包含以下六个核心步骤：

流程一：基因克隆、生物信息学与表达模式分析 1. 研究对象与样本：以玉米骨干自交系B73和ZC01为材料。从B73中克隆ZmPHYC1 (Zm00001d034038) 和ZmPHYC2 (Zm00001d013262) 的编码序列。用于表达分析的样本包括B73六叶期幼苗的不同组织（根、中胚轴、胚芽鞘、叶），以及ZC01在人工控制长日照（LD，16h光/8h暗）和短日照（SD，8h光/16h暗）条件下三叶期幼苗的叶片（在不同 Zeitgeber 时间点取样）。 2. 实验方法与处理： * 生物信息学分析：对ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白进行多序列比对，确认其保守结构域（PAS, GAF, PHY, HisKA等）。构建系统进化树，明确其与水稻、拟南芥PhyC的同源关系。 * 表达谱分析：使用实时定量PCR（RT-qPCR）技术。对组织样本，检测两个基因在各器官中的表达量。对时间序列样本，检测其在LD和SD条件下的昼夜表达节律。以玉米*Tubulin 5*基因作为内参。

流程二：蛋白亚细胞定位与互作研究 1. 研究对象：构建*ZmPHYC1-GFP*和*ZmPHYC2-GFP*融合蛋白表达载体。 2. 实验方法与处理： * 亚细胞定位：通过农杆菌瞬时转化法，将上述载体与本氏烟草叶片表皮细胞共注射，同时注射一个核定位标记蛋白（MRFP-AHL22）。在光照条件下培养后，使用共聚焦显微镜观察GFP（绿荧光）和RFP（红荧光，标记细胞核）信号，确定蛋白定位。 * 蛋白互作验证： * 萤光素酶互补成像实验（LCI）：将*ZmPHYC1/2*的编码序列分别与萤光素酶N端（NLuc）或C端（CLuc）融合，构建一系列载体。在烟草叶片中成对共注射（如ZmPHYC1-NLuc + ZmPHYC2-CLuc；ZmPHYC1-NLuc + ZmPHYB1-CLuc等），喷洒底物荧光素后，利用活体成像系统检测发光信号，判断蛋白间是否存在相互作用。 * 双分子荧光互补实验（BiFC）：将*ZmPHYC1/2*和*ZmPHYB1/2*的编码序列分别与黄色荧光蛋白（YFP）的N端（YN）或C端（YC）融合。在烟草叶片中共注射配对组合，通过共聚焦显微镜观察是否能重建YFP荧光信号，进一步验证互作及其发生部位（如细胞核内）。

流程三：拟南芥异源表达与功能互补分析 此部分旨在利用成熟的拟南芥研究体系，快速验证ZmPHYCs保守的生物学功能。 1. 研究对象：拟南芥野生型Columbia-0 (Col-0) 和*phyC-2*功能缺失突变体。 2. 遗传材料构建：将*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*的编码序列构建在强启动子（*proubi*）驱动、并融合GFP标签的表达载体上。通过农杆菌介导的花序浸染法，分别转化到拟南芥*phyC-2*突变体和Col-0野生型背景中，获得超表达转基因株系。 3. 实验方法与表型分析： * 幼苗光形态建成：将野生型、*phyC-2*突变体、以及在Col-0或*phyC-2*背景下的ZmPHYCs超表达株系的种子，播种在培养基上，分别置于黑暗、持续红光（Rc）、持续远红光（FRc）或持续蓝光（Bc）条件下生长4天。测量下胚轴长度，分析ZmPHYCs对光信号的响应。 * 互补实验：重点比较*phyC-2*突变体与在*phyC-2*背景下表达ZmPHYCs的株系在持续红光下的下胚轴长度，验证ZmPHYCs能否挽救*phyC-2*的长下胚轴表型。 * 避荫反应模拟：将幼苗在正常白光下生长2天后，一部分继续白光培养，另一部分在每日光周期结束时给予30分钟远红光照射（EOD-FR处理），模拟遮荫。5天后比较不同基因型幼苗的下胚轴伸长程度。同时，通过RT-qPCR检测拟南芥中已知的避荫反应标记基因（HFR1, YUC2, HB2, *PIL1*）的表达水平变化。 * 开花时间观察：在长日照条件下，记录*phyC-2*突变体与互补株系的抽薹开花时间。

流程四：利用CRISPR/Cas9技术创制玉米ZmPHYCs双突变体 这是本研究的关键创新之一，直接在玉米中敲除目标基因以研究其内源功能。 1. 研究对象与载体构建：以玉米自交系ZC01为受体。针对*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*基因第一外显子上高度同源的区域，设计两个相同的单向导RNA（sgRNA）靶点。将这两个sgRNA表达盒（分别由玉米U6-1和U6-2启动子驱动）构建到携带Cas9的CPB载体中，形成双靶点CRISPR/Cas9编辑载体。 2. 遗传转化与突变体鉴定：通过农杆菌介导法转化ZC01幼胚。对获得的T0代转基因植株，通过PCR扩增靶点区域并进行测序，鉴定基因编辑事件。筛选在*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*两个基因位点均发生移码或缺失突变（导致功能丧失）的植株。通过自交，在T1和T2代中筛选纯合的双突变体，最终获得三个独立的纯合株系（ko#1, ko#3, ko#7）。同时，将不含CRISPR载体的野生型分离株（CK）作为转基因对照。

流程五：玉米过表达株系的创制与表型分析 为了研究基因功能增益的效果，并观察与突变体表型的异同。 1. 研究对象与载体构建：同样以ZC01为受体。使用与拟南芥转化相同的*proUbizmPHYC1/2-GFP*过表达载体。 2. 遗传转化与株系筛选：通过农杆菌介导法转化玉米，利用除草剂Basta筛选阳性植株。通过RT-qPCR验证*ZmPHYC1*或*ZmPHYC2*在转基因植株中的表达水平显著提高，并选择两个独立的高表达株系进行后续研究（ZmPHYC1-OE: oe3, oe8；ZmPHYC2-OE: oe7, oe12）。

流程六：玉米突变体与过表达株系的田间表型鉴定与分子机制初探 1. 田间试验设计：将野生型ZC01、三个双突变体纯合系（ko#1, #3, #7）、两个过表达株系以及转基因对照（CK），分别种植于河北廊坊（北纬39°，代表长日照条件）和海南乐东（北纬18°，代表短日照条件）的田间。设置合理的株行距，模拟群体环境。 2. 表型数据采集：每个株系随机选择至少10株，系统调查以下农艺性状：开花期（以雄穗散粉为准）、总叶片数、株高、穗位高。 3. 分子机制分析：为了解开花时间变化的潜在原因，在人工控制LD和SD条件下，于七叶期取野生型和双突变体的叶片，进行时间序列取样。通过RT-qPCR分析玉米中已知的光周期和开花途径关键基因的表达模式，包括成花素基因*ZCN8*、光周期通路关键因子*CONZ1*、以及生物钟相关基因*ZmCCT9*和*ZmCCA1*。

数据分析工作流：所有定量数据（如下胚轴长度、基因表达量、农艺性状测量值）均进行至少三次生物学重复。使用Student‘s t检验分析两组数据间的差异显著性（如互补实验）。对于多组比较（如不同基因型间的表型差异），则采用LSD方法并进行Bonferroni校正，以p<0.05作为差异显著的标准。

三、 主要研究结果

结果一：ZmPHYCs的分子特性与表达模式 系统进化分析证实ZmPHYC1和ZmPHYC2属于II型光敏色素，与水稻OsPHYC亲缘关系最近。RT-qPCR显示，两个基因在玉米各组织中均有表达，但*ZmPHYC1*的表达量在所有组织中均显著高于*ZmPHYC2*。更重要的是，*ZmPHYC1*的表达呈现明显的昼夜节律性，在LD和SD条件下均在黄昏后4小时达到峰值，而*ZmPHYC2*的表达则无明显节律。这提示两个同源基因可能发生了亚功能分化。亚细胞定位实验表明，在光照条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白均同时定位于细胞核和细胞质。蛋白互作实验（LCI和BiFC）证明，ZmPHYC1和ZmPHYC2不仅能与自身形成同源二聚体，也能相互形成异源二聚体，还能与玉米的II型光敏色素ZmPHYB1和ZmPHYB2发生相互作用，这表明它们可能通过形成不同的蛋白复合体来行使功能。

结果二：ZmPHYCs在拟南芥中具有保守的光敏色素功能并抑制避荫反应 在拟南芥中的功能验证取得了关键证据： 1. 互补红光反应缺陷：在持续黑暗下，所有株系下胚轴无差异。但在持续红光下，*phyC-2*突变体表现出典型的长下胚轴表型，而表达*ZmPHYC1*或*ZmPHYC2*的*phyC-2*背景植株，其下胚轴长度被显著缩短，恢复到接近野生型水平，证明ZmPHYCs能够完全互补拟南芥PhyC的功能缺失。 2. 介导红光和蓝光信号：在Col-0背景下过表达*ZmPHYC1*或*ZmPHYC2*，转基因幼苗在持续红光和蓝光下表现出超敏感反应（下胚轴比野生型更短），但在持续远红光下与野生型无差异。这表明ZmPHYCs主要参与红光和蓝光介导的幼苗光形态建成，而非远红光反应。 3. 减弱避荫反应：在EOD-FR模拟遮荫处理下，野生型拟南芥幼苗下胚轴显著伸长，而过表达*ZmPHYC1*或*ZmPHYC2*的株系下胚轴伸长程度明显减弱。同时，这些转基因株系中四个避荫反应标记基因（HFR1, YUC2, HB2, *PIL1*）的诱导表达水平也显著低于野生型。这直接证明ZmPHYCs在异源系统中能够负调控避荫反应。 4. 对开花时间的影响：一个有趣的发现是，在拟南芥*phyC-2*突变体（LD下晚花）背景下过表达*ZmPHYC1*或*ZmPHYC2*，反而促进了开花，表现出与在玉米中相反的趋势，这可能反映了单子叶植物（玉米）与双子叶植物（拟南芥）在光周期调控网络上的差异。

结果三：ZmPHYCs双敲除导致玉米长日照条件下早花 通过CRISPR/Cas9成功获得了三个*ZmPHYC1 ZmPHYC2*双敲除纯合突变体。测序显示这些株系在两个基因的靶点区域均发生了不同类型的移码或缺失突变，导致蛋白功能丧失。田间表型分析显示： * 在自然长日照条件下，三个双突变体均比野生型和转基因对照（CK）提前4-6天开花（散粉），但总叶片数没有显著变化（除ko#3外），表明其早花是由于发育速率加快而非叶片数减少所致。 * 在株高和穗位高方面，除ko#3略矮外，其他突变体与野生型无显著差异。 * 在自然短日照条件下，双突变体未表现出早花表型。这说明ZmPHYCs主要在长日照条件下发挥开花抑制作用。 * 分子机制探索发现，在长日照下，双突变体中玉米成花素基因*ZCN8*及其上游正调控因子*CONZ1*的表达水平在整个昼夜周期内均高于野生型，这与早花表型一致。而生物钟基因*ZmCCT9*和*ZmCCA1*的表达未受影响，提示ZmPHYCs可能通过影响光周期通路下游的*CONZ1-ZCN8*模块来调控开花。

结果四：过表达ZmPHYC2可适度降低玉米株高 对过表达株系的田间表型分析发现了一个具有潜在育种价值的性状： * 过表达*ZmPHYC2*的两个独立株系，其株高和穗位高均比野生型有适度但显著的降低。然而，它们的开花时间和总叶片数与野生型无差异。 * 相比之下，过表达*ZmPHYC1*的株系在株高、穗位高和开花时间上均与野生型无异。 * 这一结果进一步支持了*ZmPHYC1*和*ZmPHYC2*可能存在功能分化，并且ZmPHYC2在调控株高方面具有更突出的作用。

四、 研究结论与意义

本研究系统性地揭示了玉米光敏色素C（ZmPHYC1和ZmPHYC2）的生物学功能，并得出以下核心结论： 1. ZmPHYC1和ZmPHYC2是功能保守的II型光敏色素：它们能够感知红光/蓝光信号，调控幼苗发育，并在异源系统中抑制避荫反应。 2. ZmPHYCs是玉米长日照条件下开花的抑制因子：通过内源基因敲除实验首次证明，缺失ZmPHYCs功能会导致玉米在长日照下早花，其分子机制可能与上调成花素基因*ZCN8*及其调控因子*CONZ1*的表达有关。 3. ZmPHYC2是调控玉米株高和穗位高的负调控因子：过表达*ZmPHYC2*能够适度降低植株高度，而不影响开花时间，这为改良株型提供了新靶点。 4. ZmPHYC1和ZmPHYC2可能存在亚功能分化：两者在表达模式（节律性 vs 非节律性）和对株高的调控效果上存在差异。

本研究的科学价值在于首次在玉米中阐明了PhyC亚家族的功能，丰富了对单子叶作物光信号传导网络的理解，特别是揭示了光敏色素在调控玉米开花时间和株型这两个关键农艺性状中的作用机制，填补了该领域的知识空白。

其应用价值尤为突出： * 为耐密植育种提供新靶点：过表达*ZmPHYC2*可降低株高和穗位高，有望增强植株在高密度下的抗倒伏