本研究的主要作者包括Cody A. Cunningham（第一作者）、Suzanne Hoppins和Pamela J. Fink（通讯作者）。Cody A. Cunningham与Pamela J. Fink均来自美国华盛顿大学免疫学系，Cody A. Cunningham发表时的工作单位为华盛顿大学，当前地址为梅奥诊所医学院亚利桑那分校；Suzanne Hoppins来自华盛顿大学生物化学系。这项研究成果发表于美国免疫学家协会的官方期刊《The Journal of Immunology》上，于2018年7月31日在线发表，并正式刊登在2018年8月1日的期刊上，文章DOI号为10.4049/jimmunol.1800705。
从学术背景来看，这项研究属于免疫学，特别是T细胞生物学和免疫代谢学的交叉领域。研究聚焦于一类特殊的T细胞群体——近期胸腺迁出细胞（Recent Thymic Emigrants, RTEs）。这些细胞是刚刚完成胸腺选择并迁出至外周淋巴器官的T细胞，在表型和功能上与其更成熟的初始T细胞（Mature Naïve T Cells）不同。此前的研究已知，抗原（Ag）激活的CD8+ RTEs比成熟的T细胞效应功能更弱，这部分归因于其有氧糖酵解速率较低（这一缺陷可通过外源性IL-2纠正），进而影响了干扰素-γ（IFN-γ）的产生。线粒体作为细胞功能的节点调控器，其作用至关重要，但在此之前，线粒体代谢在RTEs独特生物学特性中的作用尚不明确。因此，本研究的目的是探究CD8+ RTEs在活化后，其线粒体代谢（特别是氧化磷酸化，Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）是否也存在缺陷，并阐明这种缺陷的分子机制，从而更深入地理解RTEs的功能局限性。
研究采用了详细且严谨的实验流程，主要可以分为以下几个步骤：细胞分选与活化、细胞代谢功能测定、细胞内分子表达分析、线粒体形态与质量观测、信号通路探究以及统计分析。
首先，在研究对象的获取与处理上，研究人员使用了转基因小鼠模型。他们从Rag2p-GFP转基因小鼠中分选出CD8+ RTEs（GFP+）和成熟的初始T细胞（MN, Mature Naïve， GFP-）。这些细胞均为OT-I TCR转基因T细胞，其TCR特异性识别鸡卵清蛋白肽段SIINFEKL（呈递在H-2Kb分子上）。这确保了所有被研究的T细胞具有相同的抗原特异性。细胞分选后，以每孔1×10^5个T细胞与5×10^5个经过辐照的、作为抗原呈递细胞（APCs）的TCRβ/δ双敲除（TCRbd-/-）小鼠或CD80/CD86双敲除（CD80/86-/-）小鼠的脾细胞共培养。刺激条件为添加10 nM的SIINFEKL肽段，并在部分实验组中添加20 U/mL的重组小鼠IL-2（rIL-2）。细胞在37°C、7% CO2的条件下培养3天。使用CD80/86-/-的APCs是为了在活化过程中阻断CD28共刺激信号，从而探究CD28信号的作用。
其次，在代谢功能测定方面，研究使用了海马（Seahorse）XF24生物能量分析仪来实时测量细胞的耗氧率（Oxygen Consumption Rate, OCR），这是评估线粒体氧化磷酸化功能的关键指标。实验时，将活化后的T细胞（1×10^6个/孔）铺于包被有Cell-Tak的微孔板中，在含有10 mM葡萄糖的无缓冲液中平衡后，先测量基础OCR，然后依次注入寡霉素A（抑制ATP合酶）、FCCP（解偶联剂，使线粒体呼吸达到最大容量）以及鱼藤酮/抗霉素A（抑制电子传递链复合物I和III），从而计算出基础呼吸、最大呼吸以及备用呼吸容量（Spare Respiratory Capacity, SRC）。为了评估谷氨酰胺代谢的作用，还在含不同浓度谷氨酰胺（0.2 mM vs 2 mM）的条件下测量了OCR。
第三，对于细胞内分子表达的分析，研究采用了流式细胞术进行细胞表面和细胞内染色。表面标记包括CD28、4-1BB、ICOS等共刺激分子。对于细胞内蛋白，如谷氨酰胺酶（Glutaminase, GLS）、肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1a）、电压依赖性阴离子通道1（VDAC1，线粒体外膜蛋白，用于指示线粒体质量）、ATP合成酶β亚基（ATP5B）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1a，线粒体生物发生的主调控因子）以及磷酸化的信号分子（如p-S6, p-p38, p-NF-κB），细胞先进行表面染色，然后使用固定破膜剂处理，再进行胞内染色。对于细胞因子IL-2，则在活化6小时后，使用蛋白转运抑制剂（GolgiPlug）阻断分泌，然后进行胞内染色检测。
第四，在线粒体形态与结构观测上，研究运用了宽场荧光显微镜和透射电子显微镜（TEM）两种技术。对于形态学，使用MitoTracker Red CMXRos染料对活细胞线粒体进行染色，用NucBlue染色细胞核，在宽场显微镜下成像，并依据形态（碎片化、中间型、网状型）对线粒体进行分类计数。对于超微结构，将活化后的细胞制备成70 nm超薄切片，用透射电镜观察并测量线粒体嵴的最大宽度，以评估嵴结构的紧密度。
第五，在信号通路探究部分，除了使用CD80/86缺陷的APCs来全局性阻断CD28-B7相互作用外，还通过流式细胞术检测了CD28下游信号分子p-S6（S240/S244）的磷酸化水平，以及4-1BB下游信号分子p-p38和p-NF-κB的磷酸化水平，以比较RTEs与成熟T细胞在接收到共刺激信号后的强度差异。
最后，所有统计分析均在GraphPad Prism软件中进行。对于配对样本（如RTEs vs. 来自同一只小鼠的成熟T细胞），主要使用配对双尾Student t检验；对于非配对数据，则使用非配对t检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
研究取得了一系列明确且相互关联的结果，逐步揭示了RTEs线粒体代谢缺陷的图景。
在第一部分关于氧化磷酸化缺陷的验证中，结果发现，虽然静息状态的RTEs与成熟T细胞具有相似的OCR，但在抗原活化后，成熟T细胞的OCR和SRC均显著诱导升高，而RTEs的这种诱导则显著减弱。关键的是，即使在外源性IL-2存在的情况下（已知IL-2能纠正RTEs的糖酵解缺陷），RTEs的OCR和SRC缺陷依然无法被纠正。同时，IL-2的生产（已知依赖于线粒体代谢）在RTEs中也是缺陷的，且不被IL-2纠正。这提示RTEs的线粒体功能存在独立于糖酵解调控的固有缺陷。
为了探究缺陷原因，研究检测了与线粒体代谢底物利用相关的酶。发现活化后的RTEs在诱导表达GLS（谷氨酰胺分解的关键酶）和CPT1a（脂肪酸氧化的限速酶）方面存在显著缺陷，且GLS的缺陷同样不被外源性IL-2纠正。功能实验进一步证实，降低培养基中的谷氨酰胺浓度会显著降低活化成熟T细胞的OCR，但对RTEs的OCR没有影响，说明RTEs本就未能有效利用谷氨酰胺来驱动OXPHOS。
接下来，研究转向了线粒体本身的质量和形态。通过检测VDAC1和ATP5B的表达水平，发现静息时两者相当，但活化后RTEs的线粒体质量积累显著低于成熟T细胞，且这一缺陷也不被IL-2纠正。显微镜观察显示，活化后的成熟T细胞线粒体大多呈碎片化，而RTEs则含有更多中间型和网状型的、更长的线粒体。电镜分析进一步揭示，尽管RTEs的线粒体嵴结构更紧（通常与更高的呼吸效率相关），但其线粒体质量的大幅减少抵消了形态上的潜在优势。与线粒体生物发生相关的转录辅激活因子PGC-1a的表达分析显示，活化后的RTEs中PGC-1a的诱导水平也显著降低，且不被IL-2恢复。这从机制上解释了线粒体质量不足的原因。
那么，是什么导致了RTEs中PGC-1a诱导不足和线粒体质量缺陷呢？研究将目光投向了共刺激信号。流式分析发现，静息时RTEs的CD28表达量就略低于成熟T细胞，活化后RTEs表达的CD28、4-1BB和ICOS均显著较低。有趣的是，在IL-2存在下活化时，RTEs的CD28和ICOS表达可恢复至与成熟T细胞相当，但4-1BB的表达依然较低。由于IL-2无法挽救线粒体缺陷，而CD28信号已知能调控线粒体代谢，研究推测CD28信号减弱可能是关键。
为了验证这一点，研究使用CD80/86双敲除的APCs来提供抗原刺激但阻断CD28信号。结果显示，在缺乏CD28信号的情况下，活化后的成熟T细胞和RTEs的线粒体质量（VDAC1表达）、PGC-1a表达水平以及p-S6磷酸化水平变得没有差异。同时，两者线粒体的嵴结构都保持紧密（未发生活化诱导的增宽）。这表明，RTEs在正常活化条件下所表现的线粒体质量缺陷、PGC-1a诱导不足，本质上可归因于其接收到的CD28信号较弱（源于其基线CD28表达较低）。对4-1BB下游信号p-p38和p-NF-κB的检测发现两者在RTEs和成熟T细胞中相似，且阻断4-1BB配体并不影响VDAC1水平，排除了4-1BB信号缺陷的主要责任。
基于以上所有结果，本研究得出了明确的结论：抗原激活的CD8+近期胸腺迁出细胞（RTEs）存在固有的线粒体代谢缺陷，表现为氧化磷酸化（OXPHOS）和备用呼吸容量（SRC）降低。这一缺陷是由多个相互关联的因素导致的：RTES的CD28基础表达较低，导致活化后CD28信号强度不足；较弱的CD28信号进而引起PGC-1a诱导不充分，限制了线粒体生物发生和线粒体质量的积累；同时，GLS（谷氨酰胺酶）的诱导也发生障碍，削弱了谷氨酰胺分解代谢对TCA循环和呼吸链的燃料供应。最重要的是，与糖酵解缺陷可被外源性IL-2纠正不同，这些线粒体代谢方面的异常是“硬接线”的，无法被IL-2逆转。这意味着在RTEs中，IL-2主要调控糖酵解代谢的速率，而其独特的线粒体代谢谱则由CD28等信号预先设定。
这项研究具有重要的科学价值和应用意义。在科学价值上，它首次系统阐明了RTEs功能缺陷的代谢新维度——线粒体代谢失调，并揭示了其与共刺激信号（CD28）的分子联系，深化了我们对T细胞早期外周成熟过程及其代谢重编程的理解。它提出了一个“解耦联”模型：在过渡期的RTEs中，糖酵解和线粒体代谢受到不同层次和机制的调控。在应用价值上，研究提示，那些主要由RTEs主导的免疫应答（例如新生儿免疫、成年人在经历治疗性或意外淋巴细胞清除后的免疫重建期），其T细胞反应效能可能受到这种固有代谢限制的影响。这为优化疫苗策略、改善免疫重建、乃至增强肿瘤免疫治疗（其中CD8+ T细胞的线粒体代谢是疗效的关键决定因素）提供了新的思考角度，即需要特别关注T细胞亚群的代谢状态和共刺激环境。
本研究的亮点突出。首先，在发现层面，它揭示了RTEs中糖酵解与线粒体代谢调控的“解耦联”现象，这是该领域的一个重要新认知。其次，在机制层面，它将线粒体缺陷溯源至CD28信号减弱和PGC-1a/GLS诱导障碍，逻辑链条清晰完整。第三，在方法层面，研究整合了多种先进技术，从海马能量代谢分析、高内涵流式细胞术到超分辨显微成像和电镜超微结构分析，多维度、多层次地证实了表型和机制。最后，在研究对象上，聚焦于生理和病理状态下都具有重要意义的RTEs群体，其研究结论具有明确的生理和潜在临床相关性。
此外，研究中还有一些有价值的细节，例如发现RTEs线粒体形态更倾向于伸长/网状，这通常与记忆前体细胞或静息状态相关，可能暗示其分化倾向或存活优势；以及提出GLS基因位点可能在RTEs中处于不同的表观遗传状态，这为后续研究留下了有趣的方向。这项工作为T细胞发育、免疫代谢和共刺激生物学领域贡献了扎实而新颖的数据和见解。