本篇研究论文《组合NRPS/PKS途径调控与形态工程增强解淀粉芽孢杆菌中iturin A的生产》于2025年发表在期刊 Chemical Engineering Journal 上，其第一作者及通讯作者单位为天津大学化工学院、系统生物工程教育部重点实验室等机构。
这项研究针对生物表面活性剂iturin A工业化生产效率低下的瓶颈问题，通过一系列系统的代谢工程与合成生物学策略，成功构建了一株iturin A高产菌株。Iturin A是一种由芽孢杆菌属细菌通过非核糖体肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）和聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）杂合途径合成的环状脂肽。因其卓越的抗真菌活性、生物相容性和安全性，在食品保鲜、制药和农业生物防治领域具有广泛应用潜力。然而，其工业生产面临产量低、代谢流分配复杂、菌株自身存在竞争性代谢途径（如合成表面活性素、fengycin）以及易形成代谢惰性孢子等诸多挑战。本研究旨在通过综合工程策略，克服这些限制，构建一株具有工业应用潜力的iturin A超产菌株。
研究的详细工作流程分为多个连续的工程步骤，每一环节均针对特定的限制因素进行改造，并基于上一步的结果进行优化。研究以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HM618为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统进行所有遗传操作。主要流程如下：
第一步：阻断胞外聚合物合成以优化发酵环境。 研究者首先关注到野生型菌株在发酵过程中会大量分泌胞外聚合物，尤其是γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid, γ-PGA），导致发酵液粘度过高，严重影响氧和营养物质传递效率。为此，研究团队敲除了负责γ-PGA合成的关键基因簇 *capBCA*，构建了工程菌ITUH01。实验结果显示，该操作使胞外聚合物产量从30.18 g L⁻¹锐减至5.90 g L⁻¹，发酵液粘度从9.80 mPa·s大幅降低至1.32 mPa·s。这一改变不仅减轻了细胞的代谢负担，还显著改善了传质条件，使得菌株ITUH01的生物量（最大OD600达81.45）和iturin A产量（72小时达1.22 g L⁻¹）相比对照菌株ITUH00（OD600 45.04，iturin A 0.69 g L⁻¹）均实现了显著提升，增幅分别约为81%和76.8%。这一结果为后续的代谢流重定向奠定了基础。
第二步：强化NRPS/PKS合成途径核心表达。 在改善了发酵物性环境后，研究重点转向iturin A自身的生物合成途径。iturin A的合成由 *ituD*、 *ituA*、 *ituB*、 ituC 基因簇编码的NRPS/PKS模块完成。为了增强该途径的表达，研究者尝试了多种启动子强化策略。首先，在天然启动子 pitu 附近插入不同的强启动子（*pveg*、 *psrfA*、 *p43*）。发现将 pveg 启动子插入 pitu 下游构建的菌株ITUH05效果最佳，iturin A产量提升至2.12 g L⁻¹。随后，研究进一步精细化调控：从菌株基因组中筛选出具有更强驱动能力的合成启动子元件（如pH03），其表达强度经绿色荧光蛋白报告系统验证为 pveg 的2.53倍。将该pH03启动子用于强化整个 itu 基因簇的表达，构建了菌株ITUH14。定量PCR结果显示，该操作引发了基因簇的共转录增强。菌株ITUH14的iturin A产量达到2.63 g L⁻¹，比ITUH05进一步提高24.1%。这一步骤的核心成果是显著提升了合成途径的转录效率。此外，研究者还探索了过表达途径起始模块基因 *ituD*（负责脂肪酸链合成）的效果，但发现过量表达反而导致产量下降30.8%，这表明途径内部各模块的表达需要精细平衡，而非单纯增强单个基因。
第三步：抑制孢子形成以维持细胞代谢活性。 芽孢杆菌在不利环境下会启动孢子形成程序，进入代谢休眠状态，这显然不利于次级代谢产物的持续合成。为了将细胞维持在代谢活跃的营养体状态，研究者瞄准了孢子形成的关键转录因子 sigE 和 *sigF*。通过敲除这两个基因，构建了双重敲除菌株ITUH18。孢子染色实验证实，ITUH18完全丧失了形成孢子的能力，而对照菌ITUH14则能正常产孢。这一改造带来了显著的产量提升：ITUH18的iturin A产量高达3.74 g L⁻¹，比ITUH14提升了42.2%。比生产率分析显示，在发酵0-24小时和24-48小时，ITUH18的比生产率分别是ITUH14的2.44倍和3.76倍，说明抑制孢子形成极大地加速了iturin A的合成速率。尽管敲除 sigE/sigF 导致菌株最大生物量有所降低（OD600从81.03降至31.08），生存力下降，但单位细胞的产率大幅提高，净效应是总产量显著增加。尝试使用弱启动子部分抑制孢子形成相关基因虽能改善生长，却未能进一步提高产量，说明完全阻止孢子形成程序对于最大化iturin A合成至关重要。
第四步：应用形态工程调控细胞分裂以提升产量。 在抑制孢子的基础上，研究者进一步探索了细胞形态与代谢产率的关系。EzrA是调控细菌细胞分裂关键蛋白FtsZ环形成的关键因子。研究者在ITUH18菌株中利用强启动子pH03过表达 ezrA 基因，构建了菌株ITUH24。扫描电镜观察发现，ITUH24的细胞显著伸长，平均长度从1.39 μm增至1.94 μm。定量PCR证实 ezrA 表达水平上调了约90倍。这种细胞分裂的调控带来了积极效果：ITUH24的生物量恢复增长至OD600 40.38，同时iturin A产量进一步提升至4.09 g L⁻¹，比ITUH18增加9.4%。这表明，通过调控细胞分裂使细胞形态拉长，可能有利于细胞内代谢物的积累或运输，从而提高了目标产物的合成能力。
第五步：在生物反应器中放大培养以验证工业潜力。 最后，研究将最优工程菌株ITUH24置于7.5 L生物反应器中进行规模放大验证，比较了分批发酵和补料分批发酵策略。在分批发酵中，iturin A产量在48小时达到峰值5.47 g L⁻¹，生产率高达0.114 g L⁻¹ h⁻¹。然而，由于后期营养耗竭，产量无法继续增长。采用补料分批发酵策略（从24小时开始补加葡萄糖和营养物质）后，虽然生产率降至0.084 g L⁻¹ h⁻¹，但通过延长生产周期，在72小时获得了更高的终产量6.03 g L⁻¹。溶解氧和pH监控数据支持了营养补充对于维持细胞活性和延长产物合成期的重要性。这一步骤证实了工程菌株在可控发酵环境下的高性能和可放大性。
本研究获得的主要结果环环相扣，每一步的改造都基于上一步的成果，并针对新的限制因素进行突破。从降低发酵液粘度（步骤一），到强化合成途径（步骤二），再到维持细胞活性（步骤三）和优化细胞形态（步骤四），最终在放大培养中实现高产（步骤五），形成了一个逻辑严密的系统工程范例。每个步骤的关键数据，如聚合物产量、粘度、iturin A浓度、OD600、比生产率、基因表达水平、细胞形态尺寸以及发酵动力学参数，都清晰地支撑了各步骤的有效性和必要性，并共同导向最终的高产结论。
本研究的结论是，通过组合多种工程策略——包括减少胞外聚合物合成、强化NRPS/PKS途径、抑制孢子形成和应用形态工程——能够系统性地解除解淀粉芽孢杆菌生产iturin A的多重限制，成功构建出具有工业应用前景的高产菌株。最终工程菌株在生物反应器中的产量达到了目前已知报道的最高水平之一。该研究的意义与价值主要体现在两方面：在科学价值上，它展示了一种针对复杂天然产物微生物合成的系统性“解限”工程思路，将代谢工程、途径工程与细胞生理调控（孢子形成、细胞分裂）有机结合，为其他微生物次级代谢产物的高产菌株构建提供了可借鉴的范式；在应用价值上，该研究直接推动了iturin A工业化生产的进程，获得的工程菌株和发酵工艺参数为大规模、低成本生产这种高价值的生物防腐剂和生物农药奠定了基础，具有显著的经济和社会效益。
本研究的亮点突出：首先，其最重要的发现是揭示了在芽孢杆菌系统中，抑制孢子形成对于大幅提高脂肽类次级代谢产物的比生产率具有关键作用，这一发现超出了传统的代谢途径强化范畴。其次，研究方法的创新性体现在采用了从启动子元件挖掘、基因簇表达精细调控到细胞形态工程的多层次、组合式改造策略，而非单一手段。特别是利用CRISPR/Cas9系统进行高效的基因组编辑，以及通过启动子工程和5‘-UTR优化来精细控制基因簇表达强度，展现了现代合成生物学工具的威力。最后，研究目标的特殊性在于瞄准了一个具有重要应用前景但生产瓶颈明显的天然产物，其系统工程的成功实施直接回应了产业需求，实现了从基础研究到应用潜力的有效贯通。此外，研究中对工程步骤的定量分析（如比生产率比较）和严格的发酵过程监控，也为理性设计与评估工程菌株性能提供了详实的数据支撑和方法学参考。