GSK3通过调控STARD3磷酸化开关来调节溶酶体定位与膜接触位点的研究报告
本研究的主要作者是来自法国斯特拉斯堡大学（Université de Strasbourg）人类遗传与分子细胞生物学研究所（Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, IGBMC）的Julie Eichler、Corinne Wendling、Sophie Huver等，以及来自法国蔚蓝海岸大学（Université Côte d’Azur）分子药理学与细胞学研究所（Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire）的Guillaume Drin等，通讯作者为Catherine Tomasetto与Fabien Alpy。该研究于2026年2月25日在线发表于*The EMBO Journal*期刊2026年第45卷第7期，标题为《STARD3通过GSK3控制的磷酸化开关调节溶酶体定位与接触》。
一、 学术背景 该研究属于细胞生物学领域，聚焦于细胞内膜接触位点（Membrane Contact Sites, MCSs）的形成与调控机制。MCSs是两个细胞器膜紧密接近但不融合的动态区域，在脂质交换、钙离子信号传导和细胞器定位等细胞稳态过程中发挥关键作用。内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）作为细胞内的中央枢纽，与多种细胞器形成MCSs。其中，晚期内体/溶酶体（Late Endosome/Lysosome, LE/Lys）与ER之间的接触及其调控机制是研究热点之一。
STARD3（STAR相关脂质转移结构域蛋白3）是一种定位于LE/Lys的胆固醇转移蛋白，其非结构化区域含有一个非传统的磷酸化FFAT基序（phospho-FFAT motif，两个苯丙氨酸位于一个酸性序列中）。先前研究发现，该基序中丝氨酸209（Serine 209, S209）的磷酸化对于STARD3与ER驻留蛋白VAPs（Vesicle-associated membrane protein-Associated Proteins，包括VAP-A、VAP-B）及MOSPD2的相互作用至关重要，从而激活其栓系活性，促进ER-LE/Lys接触位点的形成和胆固醇运输。然而，尽管磷酸化蛋白质组学数据已证实STARD3的S209位点确实可被磷酸化，但负责这一关键磷酸化事件的激酶身份一直未知。因此，识别这一激酶并阐明其如何调控STARD3功能，对于深入理解MCSs的动态调控和细胞器间通讯的分子基础具有重要意义。本研究旨在解决这一科学问题，并在此过程中探索STARD3在ER接触之外的潜在新功能。
二、 研究流程详述 本研究采用了体外（in vitro）和细胞（in cellulo）相结合的分析策略，逻辑严谨，环环相扣。主要流程可分为以下几个关键步骤：
1. 激酶识别与功能验证 * 研究样本与处理： 研究选择了两种人乳腺癌细胞系：天然高表达STARD3的HCC1954细胞和低表达的MCF7细胞。MCF7细胞被用于构建稳定过表达STARD3的细胞系（MCF7/STARD3）。此外，还使用了Hela、U2OS和COS-7等其他细胞系进行表型验证。 * 激酶预测与药理抑制： 利用PhosphoSitePlus激酶预测工具，作者推测糖原合酶激酶3α/β（Glycogen Synthase Kinase 3α/β, GSK3α/β）可能是磷酸化STARD3 S209的候选激酶。为了验证，研究使用GSK3特异性抑制剂CHIR99021处理HCC1954和MCF7/STARD3细胞，并通过Western blotting检测STARD3 S209的磷酸化水平（使用磷酸化特异性抗体）和总蛋白量变化。 * 基因沉默验证： 为了区分GSK3两个同工型的作用，在HCC1954和MCF7/STARD3细胞中，使用小干扰RNA（siRNA）分别或同时敲低GSK3α和GSK3β，然后分析STARD3 S209磷酸化水平的变化。 * 共定位分析： 在MCF7细胞中，通过免疫荧光共表达HA标记的GSK3β和野生型（WT）或S209A突变型STARD3，观察两者在细胞内的空间定位关系，特别是GSK3β是否会被招募到STARD3阳性的LE/Lys上。
2. GSK3直接磷酸化STARD3的机制解析 * 磷酸化级联依赖性的体内验证： 在MCF7细胞中表达一系列STARD3点突变体，包括S209A（靶点突变）、S213A、S217A、S221A（潜在引物位点突变）及其组合突变体。通过Western blotting检测这些突变体S209的磷酸化水平，以确定磷酸化级联关系。 * 体外激酶实验： 这是该研究的关键验证步骤，使用了多种重组蛋白： * 底物蛋白： 表达并纯化了包含STARD3胞质部分（磷酸化FFAT基序和START结构域）的CSTD3蛋白。为了模拟“引物”磷酸化状态，研究利用了一种基因重编码的大肠杆菌菌株，该菌株允许在蛋白质合成过程中直接掺入磷酸丝氨酸。他们制备了野生型CSTD3以及在其S209或S213位点组成型磷酸化的CSTD3（分别记为ps209和ps213）。S213E突变体（用谷氨酸模拟磷酸化）也被制备以测试酸性残基是否能“欺骗”GSK3。 * 激酶： 使用重组纯化的GSK3β蛋白。 * 实验设计： 将上述CSTD3蛋白变体分别与GSK3β在ATP存在下进行孵育，进行体外磷酸化反应。随后通过Western blotting使用抗ps209-STARD3抗体检测S209的磷酸化水平，从而判断GSK3β的活性是否依赖于S213的事先磷酸化。 * 质谱验证： 对CSTD3 ps213蛋白进行质谱分析，以确认S213位点确实被磷酸化（见补充图S1）。
3. GSK3调控STARD3栓系功能的体内验证 * 免疫共沉淀： 在MCF7细胞（和Hela细胞）中，共表达GFP标记的VAP-A、VAP-B或MOSPD2以及FLAG标记的STARD3。使用GFP Trap珠子进行免疫共沉淀，在有或无CHIR99021处理下，检测STARD3与VAP蛋白的相互作用。同时，使用VAP的突变体（KD/MD，无法结合FFAT基序）作为阴性对照。为了在内源性水平验证，在HCC1954细胞中使用抗STARD3抗体进行免疫共沉淀，检测内源性MOSPD2的共沉淀情况。 * 免疫荧光与共定位分析： 在MCF7细胞（和Hela细胞）中，观察GFP-VAP-A/B在过表达STARD3 WT、S209A突变体或VAP-A KD/MD突变体时的亚细胞定位变化。特别关注VAP蛋白是否在STARD3阳性的LE/Lys周围富集（这是MCS形成的形态学证据）。同时，使用CHIR99021处理，观察GSK3抑制对这种富集的影响。为了更直接地评估ER-LE/Lys的接近程度，研究还共表达了ER标记蛋白（mscarlet-ER）和LE/Lys标记蛋白（EGFP-TMEM192），并通过皮尔逊相关系数定量分析其共定位程度的变化。
4. STARD3调控LE/Lys定位新功能的发现与机制探索 * 表型观察： 在进行GSK3抑制实验时，研究意外发现LE/Lys（用抗LAMP1抗体标记）从分散的细胞质分布转变为聚集在核周区域。这一现象在HCC1954细胞、MCF7/STARD3细胞以及其他多种细胞系中均被观察到。 * 定量分析： 开发了一种基于高分辨率图像的自动化分析方法，定义了“聚集指数”，用于量化LE/Lys囊泡之间直接接触的比例。 * STARD3依赖性验证： 在HCC1954细胞中使用siRNA敲低STARD3，观察GSK3抑制后LE/Lys聚集表型是否消失。 * 磷酸化状态与表型关系： 在MCF7细胞中表达STARD3 S209A（非磷酸化型）和S209D/P210A（SD/PA，模拟组成型磷酸化型）等突变体，观察在有无GSK3抑制剂的情况下LE/Lys的定位。同时，也测试了影响引物磷酸化的S213A等突变体的表型。 * 其他细胞器标记： 通过免疫荧光共定位实验，确认聚集的结构是LE/Lys（LAMP1阳性），而非早期内体（EEA1）、高尔基体（GM130）或内质网（Calnexin）。 * 超微结构验证： 使用结构光照明显微镜（SIM）观察聚集的LE/Lys是否为独立的囊泡聚集而非融合。进一步利用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）和透射电子显微镜（TEM）对对照细胞、过表达STARD3 WT细胞和过表达FFAT缺陷型（FA/YA）突变体细胞的细胞器进行三维重建和观察，以分析ER-LE/Lys接触和LE/Lys间接触的精细结构。
5. START结构域在LE/Lys聚集中的功能与机制 * 结构域缺失与嵌合体实验： 构建了一系列STARD3突变体和嵌合蛋白： * 缺失突变体： STARD3 ΔSTART（缺失START结构域）、STARD3 ΔFFAT（缺失FFAT基序）。 * 嵌合体： * Stard3nl-START： 将STARD3的START结构域融合到其旁系同源物Stard3nl（含Mental结构域和FFAT基序，但无START结构域）上。 * TMEM192-START： 将STARD3的START结构域融合到LE/Lys驻留蛋白TMEM192的跨膜结构域上。 * Lyso-START： 将STARD3的START结构域融合到LE/Lys靶向信号（来自LAMTOR1的N端肉豆蔻酰化和棕榈酰化序列）上。 * 功能测试： 在MCF7细胞中表达这些构建体，观察它们在有无GSK3抑制剂条件下对LE/Lys定位的影响。 * START结构域生化特性分析： * 寡聚化状态： 使用分析超速离心法分析纯化的重组START结构域的沉降系数，判断其在溶液中的单体/寡聚体状态。 * 膜结合能力： * 浮选实验： 将重组CSTD3蛋白与含有不同脂质成分（中性磷脂酰胆碱PC；带负电的磷脂酰丝氨酸PS；或含有可共价结合蛋白中巯基的MPB-PE的PC/PS）的脂质体孵育，通过蔗糖梯度浮选分离膜结合蛋白，评估其与膜的亲和力。 * 脂质体下拉实验（创新方法）： 将带有His标签的START结构域固定在镍磁珠上，然后与荧光标记的脂质体孵育。洗涤后，通过共聚焦显微镜成像和定量磁珠周围结合的荧光信号，评估START结构域在固相高浓度状态下与带负电脂质体的结合能力。 * 脂质体聚集实验： 将CSTD3蛋白通过N端半胱氨酸共价连接到含有MPB-PE的脂质体上，模拟其锚定在膜上的状态。然后使用动态光散射技术监测脂质体混合物的流体动力学半径随时间的变化，以评估START结构域能否诱导脂质体（模拟LE/Lys）聚集。 * 关键残基鉴定： 基于序列比对和结构分析，将STARD3 START结构域表面两个保守的正电荷残基（K260和K281）突变为天冬氨酸（D），构建了KD/KD双突变体。通过圆二色光谱验证突变未破坏蛋白折叠，然后使用上述脂质体下拉和聚集实验评估其膜结合和促聚集功能是否丧失。 * 细胞功能回补： 在MCF7细胞中表达STARD3 KD/KD突变体以及S209A KD/KD双突变体，观察这些突变体能否在GSK3抑制或FFAT功能丧失的情况下诱导LE/Lys聚集。
三、 主要结果 1. STARD3的S209磷酸化依赖于GSK3α/β活性且二者功能冗余。 * 药理学抑制GSK3（CHIR99021处理）显著降低了HCC1954和MCF7/STARD3细胞中STARD3 S209的磷酸化水平，而不影响总蛋白量。 * siRNA单独敲低GSK3α或GSK3β对STARD3磷酸化影响不大，但同时敲低两者可导致磷酸化水平大幅下降，与药物抑制效果相当，表明两个同工型在此功能上具有冗余性。 * 免疫荧光显示，当与STARD3 WT共表达时，GSK3β被招募到STARD3阳性的LE/Lys上并与之共定位；而与STARD3 S209A共表达时，GSK3β则保持弥散分布，提示磷酸化状态影响两者的相互作用或共定位。
2. GSK3以引物依赖的方式直接磷酸化STARD3的S209。 * 在细胞中，STARD3 S213A突变完全阻断了S209的磷酸化，而S217A或S221A突变则无影响，表明S213的磷酸化是S209被磷酸化的先决条件（“引物”）。 * 体外激酶实验提供了直接证据：重组GSK3β能够磷酸化预先在S213位点被磷酸化的CSTD3（ps213），使其S209被磷酸化；但无法磷酸化野生型CSTD3或S213E突变体。组成型磷酸化的CSTD3 ps209可被ps209抗体识别，与激酶无关。 * 这些结果证实GSK3是直接磷酸化STARD3 S209的激酶，并且这一过程严格依赖于上游另一个激酶（身份待定）对S213的预先磷酸化。
3. GSK3活性是STARD3与VAPs相互作用及ER-LE/Lys接触形成的必要条件。 * 免疫共沉淀实验显示，CHIR99021处理或VAP结合缺陷突变（KD/MD）均能破坏STARD3与VAP-A、VAP-B及MOSPD2的相互作用。在内源性水平，GSK3抑制也削弱了STARD3与MOSPD2的结合。 * 免疫荧光显示，在过表达STARD3 WT的细胞中，VAP-A/B会在STARD3阳性的LE/Lys周围富集，表明ER膜被拉近形成接触。这种富集可被STARD3 S209A突变、VAP-A KD/MD突变或GSK3抑制剂CHIR99021处理所阻止。 * 使用ER和LE/Lys荧光标记蛋白的共定位定量分析进一步证实，STARD3过表达能增加ER-LE/Lys共定位，而GSK3抑制则使其恢复到基础水平。 * 这些结果强有力地证明，在体内环境下，GSK3的活性对于STARD3的栓系功能至关重要，且没有其他激酶能完全补偿其作用。
4. 当ER-LE/Lys栓系被阻断时，STARD3会促进LE/Lys的同型聚集，这是一个新发现的功能。 * GSK3抑制导致STARD3去磷酸化后，在多种细胞系中均观察到LE/Lys向核周区域聚集的表型。这种聚集是STARD3依赖性的，因为敲低STARD3后表型消失。 * 聚集表型与STARD3的磷酸化状态直接相关：表达非磷酸化突变体S209A或FFAT基序缺失/突变体（FA/YA, ΔFFAT）的细胞，即使在GSK3活性正常时也表现出LE/Lys聚集；而表达模拟组成型磷酸化的SD/PA突变体的细胞，其LE/Lys保持分散，且对GSK3抑制不敏感。同样，影响引物磷酸化的S213A突变也导致聚集。 * SIM超分辨成像显示，聚集体是由许多独立的LE/Lys小囊泡紧密堆叠而成，并非发生融合。FIB-SEM和TEM三维重建进一步证实，在STARD3 FFAT缺陷型细胞中，ER-LE/Lys接触极少，取而代之的是LE/Lys之间大量的直接膜接触，且未观察到膜融合。 * 抑制VAPs的功能（同时敲低VAP-A、VAP-B和MOSPD2）也能在STARD3过表达的细胞中诱发类似的LE/Lys聚集表型，表明当STARD3无法与ER建立联系时，其功能发生了转向。
5. STARD3的START结构域是其介导LE/Lys聚集的关键执行者，该功能依赖于其与带负电膜的结合能力。 * 缺失START结构域（STARD3 ΔSTART）完全消除了LE/Lys聚集表型，即使STARD3本身是去磷酸化的（如S209A ΔSTART）。 * 单独含有Mental结构域和FFAT基序的Stard3nl蛋白（无START结构域）或其FFAT缺失突变体，均不能诱导聚集。然而，将STARD3的START结构域融合到Stard3nl上（Stard3nl-START嵌合体）后，该嵌合体获得了在GSK3抑制下诱导聚集的能力。 * 更关键的是，仅将START结构域通过不同方式（TMEM192跨膜域或LAMTOR1脂化信号）靶向锚定到LE/Lys膜上，就足以独立诱导LE/Lys聚集，且不受GSK3调控。这证明START结构域本身具有驱动LE/Lys聚集的内在能力。 * 生化机制探索表明： * START结构域在溶液中以单体形式存在，排除了通过跨二聚化连接囊泡的可能性。 * 传统的脂质体浮选实验未能检测到START结构域与带负电膜（含PS）的强结合。 * 然而，创新的脂质体下拉实验（模拟START结构域在膜上的高局部浓度）显示，固定在磁珠上的START结构域能够