Tou等人在《ACS Synthetic Biology》期刊发表了一项将CRISPR引导的诱变系统EvolvR成功移植到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的研究。该研究由加州大学伯克利分校的Connor J. Tou、David V. Schaffer和John E. Dueber共同完成，并于2020年6月2日在线发表。
该研究的学术背景根植于合成生物学和定向进化领域。传统的体内诱变方法通常依赖“体外多样化、体内筛选”的循环模式，这一过程不仅难以规模化，且受限于转化效率。更重要的是，当获得目标表型需要多个连续的适应性突变步骤，或依赖于基因上位效应（epistatic mutations）时，这些传统方法便显得力不从心。为解决这一问题，该研究团队此前已在大肠杆菌中开发了名为EvolvR的系统，该系统能够利用CRISPR引导的切口酶（Cas9 nickase）融合具有切口平移活性（nick-translating）的易错DNA聚合酶（error-prone DNA polymerase），在用户指定的基因组位点上进行所有核苷酸的多样化。鉴于CRISPR-Cas9系统在多种细胞类型中均有活性，EvolvR技术具备被移植到包括真核生物在内的其他物种中的潜力，但其前提是其中的关键酶——切口平移DNA聚合酶——能在不同物种中保持活性。因此，本研究的核心目标是在真核模式生物酿酒酵母中实现并系统表征EvolvR的功能（命名为yEvolvR），从而为在高等真核生物中发展此项技术奠定基础。
研究团队设计了一套严谨的实验流程来验证和表征yEvolvR系统。研究的第一步是构建测试菌株和yEvolvR表达质粒。他们首先在一个名为YJD053的酿酒酵母菌株中，整合了一个含有赭石无义突变（ochre nonsense mutation）的URA3基因（ura3*），构建成新的菌株YCT01。这种ura3*基因的回复突变可作为灵敏的检测指标。随后，他们构建了yEvolvR质粒（pyEvolvR），该质粒包含一个向导RNA（gRNA）表达框和一个融合蛋白表达框。这个融合蛋白名为eCas9-Poli5M，由三个部分构成：一是带有D10A突变的切口酶Cas9（nCas9）；二是三个额外的降低非特异性DNA亲和力的突变（K848A, K1003A, R1060A），这些突变赋予其“增强型”特性（enhanced nicking Cas9, eCas9）；三是来自大肠杆菌的DNA聚合酶I（DNA polymerase I），其携带有五个降低保真度的点突变（Poli5M）。
研究的第二步是进行波动分析实验（fluctuation analysis assay），以精确量化yEvolvR的靶向突变率和全局突变率。研究者将pyEvolvR质粒转化入YCT01菌株，在选择性液体培养基中培养96小时后，将培养物涂布于不含尿嘧啶的平板上。通过计算回复突变的菌落形成单位（CFU），并利用Luria–Delbrück模型及R语言程序包rSalvador进行数据分析，估算突变率。该实验设置了多个对照组，包括表达靶向HO位点（一个非必需位点）的gRNA以评估全局突变率，以及分别单独表达eCas9或Poli5M、或使用催化失活型dCas9融合Poli5M等条件，以验证系统各组件的必要性。每组实验包含8个独立的生物学重复。
研究的第三步是优化和表征yEvolvR系统的可调性。首先是表达水平的优化。研究人员使用了一套已表征的启动子（PREV1, PRET2, PRPL18B, PTEF1, PTDH3）来驱动yEvolvR的表达，这些启动子的强度呈梯度增加。通过比较不同启动子下的靶向和全局突变率，他们旨在找到一个能使靶向突变率最大化而全局突变率最小化的最优表达水平。其次是聚合酶模块的比较。他们将Poli5M替换为其他保真度变体，如Poli1M（含单突变）、Poli2M（含双突变）和Poli3M（含三突变），以比较它们在酵母中对突变率的影响。
研究的第四步是验证yEvolvR在天然基因组内源位点上的多样化能力。团队选择了CAN1基因作为靶标，该基因编码精氨酸渗透酶，其失活会使细胞无法摄取有毒的精氨酸类似物刀豆氨酸（canavanine），从而产生抗性。通过表达靶向CAN1的gRNA，培养后涂布含刀豆氨酸的平板，计算抗性菌落的百分比，以此来衡量突变效率。该部分同时测试了系统的多重化（multiplexable）能力，即使用一个包含自剪切核酶（HDV-ribozyme）的单一转录本，产生靶向ura3*和CAN1两个位点的gRNA，看能否同时实现ura3*的回复突变和CAN1的失活。
研究的第五步是通过高通量扩增子测序（high-throughput amplicon sequencing）对靶向区域的突变图谱进行精细分析。在yEvolvR靶向CAN1基因进行诱变后，提取基因组DNA，使用特异性引物对靶标区域进行两轮总共30个循环的PCR扩增以添加测序接头和索引，随后在Illumina NovaSeq S4平台进行150 bp双端测序。下机数据使用ngmerge软件进行序列合并，Bowtie2进行比对，samtools生成mpileup文件，最后用sinple软件进行变异检出，并过滤掉可能由碱基识别错误导致的变异。
研究结果揭示了yEvolvR系统的多项关键性能。在突变率方面，波动分析结果显示，表达完整的yEvolvR（eCas9-Poli5M）时，靶向突变率相比野生型背景提高了12,434倍，达到了惊人的四个数量级，而全局突变率仅增加了90倍。相比之下，单独表达eCas9和Poli5M、只表达Poli5M、只表达eCas9或表达dCas9-Poli5M融合物时，靶向突变率的提升倍数分别仅为1,856、100、193和133倍。这一结果清晰表明，Cas9的切口活性和Poli5M的聚合酶活性对于高效靶向诱变都是必不可少的，并且通过融合的方式将聚合酶定位到切口位点，其效率比分体式表达高出7倍。
在系统优化和可调性方面，研究者发现，随着启动子强度从PREV1增加到PTEF1，靶向突变率和全局突变率均随之升高。然而，当表达强度继续增加到最强的PTDH3时，靶向突变率并未进一步提升，只有全局突变率继续增加。这表明突变率可能存在一个瓶颈，可能与Cas9蛋白在靶标DNA上的长滞留时间有关。因此，PTEF1启动子被认为是平衡靶向和全局突变率的最佳选择。在聚合酶变体比较中，正如预期那样，高保真度的Poli1M和Poli2M表现出较低的靶向突变率，而Poli3M则显示出与Poli5M大致相同的靶向突变率，这与在大肠杆菌中观察到的现象一致，说明大肠杆菌DNA聚合酶I在酿酒酵母中保留了其作为多样化工具的原有特性。
针对内源性位点CAN1的多样化实验证明了yEvolvR的强大功能。靶向CAN1的实验组中，对刀豆氨酸具有抗性的细胞百分比相较于野生型细胞暴增了9,019倍，而脱靶对照仅增加了5倍。在双重靶向实验中，只有同时表达靶向ura3*和CAN1的两种gRNA时，才在同一培养物中同时观察到大量的ura3*回复突变体和刀豆氨酸抗性（canavr）突变体。
高通量测序数据为yEvolvR的诱变特征提供了更精细的视图。结果显示，突变在预期方向上延伸了约40个碱基对的窗口内显著升高，同时，在切口上游约20个碱基对处也存在一个大体相同频率的意外突变升高区域。通过对照实验排除了这种上游突变是由单纯切口或由Poli5M从已存在的上游切口起始的错误重延伸所导致的可能性。这一特征是酿酒酵母中独有的现象，实际上扩大了有效诱变窗口的长度。在该窗口内，共检测到19,485,457条映射读长，观察到所有四种核苷酸都发生了突变，并且12种碱基替换中出现了11种，其中转换突变（transition mutations）占主导（71.3%），例如A→G、G→A、T→C和C→T。
最终，本研究得出以下结论：EvolvR技术可以成功地从原核生物大肠杆菌扩展应用到真核生物酿酒酵母，并有效实现其染色体内源位点的靶向多样化。yEvolvR系统具有高度的可调性，可通过改变启动子强度和交换聚合酶模块来调节突变率和突变谱。本研究还意外揭示了在酿酒酵母中，yEvolvR诱变在正反两个方向上发生的新现象，这提供了一个拓展的诱变窗口。该研究的科学价值在于，它不仅为在活细胞内进行定向进化和正向遗传学筛选提供了一个强大的新工具，尤其是在研究基因上位效应等需要同时靶向多基因组的复杂生物问题方面具有独特优势，而且酿酒酵母作为一种优秀的真核模式系统，以其短世代周期、可高密度生长及丰富的遗传学工具，为深入探索EvolvR在真核细胞中的作用机制（尤其是真核修复机制的影响）提供了理想平台。其应用价值在于，yEvolvR在酵母中的成功建立，证实了EvolvR介导的诱变在真核生物中的可行性，为将这一技术进一步发展到哺乳动物细胞等高等真核生物中，最终用于人类细胞内的定向进化和遗传学研究，铺平了道路。
该研究的亮点主要体现在以下几个方面。首先，它首次实现了CRISPR引导的、由原核DNA聚合酶I驱动的靶向持续诱变系统在真核生物中的功能移植，并证实该异源蛋白可有效工作。其次，研究系统性地解析了yEvolvR各组件的必要性和表达水平对诱变的影响，提供了详尽的系统表征数据。最后，研究中发现的酿酒酵母特有的双向诱变窗口不仅是一个新颖的科学发现，也为改进EvolvR系统的设计提供了新的思路。