一种新型人工二氧化碳固定循环——Theta循环的设计、构建与模块化体内实施
一、 研究作者、机构与发表情况
本研究的主要作者包括Shanshan Luo、Christoph Diehl、Hai He、Youngjun Bae、Melanie Klose、Peter Claus、Niña Socorro Cortina、Celia Alvarez Fernandez、Helena Schulz-Mirbach、Richard McLean、Adán Andrés Ramírez Rojas、Daniel Schindler、Nicole Paczia和Tobias J. Erb。研究团队主要来自德国马普学会陆地微生物研究所（Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology）的生物化学与合成代谢系、核心代谢组学与小分子质谱平台以及MaxGenesys生物铸造厂，其他合作者分别来自德国耶拿弗里德里希·席勒大学、美国Liveritas Biosciences公司以及荷兰拉德堡德大学。该项研究成果以《构建与模块化实施用于合成二氧化碳固定的Theta循环》为题，于2023年12月发表在学术期刊《自然·催化》（Nature Catalysis）上（卷6，第1228-1240页）。
二、 学术背景与研究目标
本研究属于合成生物学与代谢工程交叉领域，核心目标是设计和实现一种超越自然界现有方案的新型（new-to-nature）二氧化碳（CO₂）固定途径。自然界已知存在七条CO₂固定途径，尽管它们支撑了地球上每年超过380吉吨碳的固定，但这些自然解决方案仅占据了理论上可能路径空间的极小部分，在效率、产物灵活性及对宿主环境的适应性方面可能存在局限。合成生物学的兴起使得人们能够从第一性原理出发，自由组合酶、反应和机制，设计并实现自然界未曾进化出的、性能更优的CO₂固定路径。
此前，已有超过30条人工CO₂固定路径被理论设计出来，其中两条（CETCH循环和rGPS-MCG循环）已在体外实现，证明了人工固碳的可行性。然而，一个悬而未决的关键挑战是如何在活细胞内实现这些全新且复杂的固碳途径。这类途径通常包含多个与宿主中心碳代谢正交的代谢物和反应，在活体环境中实现面临着与宿主遗传及代谢网络发生意外相互作用、代谢负担以及调控兼容性等多重困难。实现人工固碳途径的体内集成，不仅是拓宽其应用范围和影响力的必要步骤，也是在与生命细胞背景下评估其真实性能、并与天然途径进行比较以深入理解碳固定演化与限制的关键。
因此，本研究旨在设计、构建并优化一条名为“Theta循环”（Theta cycle）的全新人工CO₂固定途径。该循环名称源于其全称“还原性三羧酸分支/4-羟基丁酰辅酶A/乙基丙二酰辅酶A/乙酰辅酶A”循环的英文首字母组合（reductive tricarboxylic acid branch/4-hydroxybutyryl-coa/ethylmalonyl-coa/acetyl-coa）。研究的具体目标包括：1）基于两个已知最高效的天然羧化酶设计Theta循环；2）在体外（in vitro）无细胞系统中成功构建并验证该循环的功能；3）通过理性和机器学习指导的优化策略大幅提升循环效率；4）将循环拆分为模块，并逐步在模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）中实现其体内（in vivo）功能，为未来完整途径的体内整合与适应性演化奠定基础。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程逻辑清晰，主要分为体外循环设计构建与优化、以及体内模块化实施两大阶段，共包含多个详细步骤。
第一阶段：Theta循环的设计、体外构建与优化
1. 循环设计： 研究团队选择了自然界已知催化性能最优越的两个CO₂固定酶作为核心：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase, PPC，反应2）和巴豆酰辅酶A羧化酶/还原酶（Crotonyl-CoA carboxylase/reductase, CCR，反应11）。PPC催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化为草酰乙酸（OAA），CCR催化巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）还原羧化为(S)-乙基丙二酰辅酶A。基于这两个核心羧化反应，研究者将其各自扩展为一个羧化模块（Module）。模块1（从丙酮酸到琥珀酸）围绕PPC设计，整合了PEP合酶（反应1）和三羧酸循环（TCA循环）还原支的三个反应。模块3（从巴豆酰辅酶A到乙酰辅酶A和丙酮酸）围绕CCR设计，整合了来自乙基丙二酰辅酶A途径和3-羟基丙酸双循环的三个反应。为了连接这两个羧化模块，研究者设计了模块2（从琥珀酸到巴豆酰辅酶A），该模块包含琥珀酰辅酶A连接酶（反应6）以及来自DC/4HB和3HP/4HB循环的四个反应。最终，三个模块共17个反应构成了一个完整的CO₂固定循环，总反应式为：CO₂ + HCO₃⁻ + 4 ATP + 3 NADPH + 2 NADH + CoA → 乙酰辅酶A + FADH₂。理论热力学分析（最小最大驱动力分析，MDF）证实该循环在生理代谢物浓度范围内（如在大肠杆菌中）是热力学可行的。
2. 体外构建与初步验证（Theta 1.0/2.0/3.0）： 研究者从9种不同生物中挑选、克隆、表达并纯化了循环所需的酶（除PPC、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶为商业购买）。初步构建的循环（Theta 1.0）包含全部17种酶及其辅因子，使用¹³C标记的碳酸氢钠（NaH¹³CO₃）作为CO₂源，以丙酮酸启动。液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测证实了单标记乙酰辅酶A的生成（总计8.5 μM，60分钟），证明了循环的基本功能。然而，发现了副产物苹果酰辅酶A的积累，这源于琥珀酰辅酶A连接酶的底物混杂性。为此，在Theta 2.0中加入了苹果酰辅酶A硫酯酶作为“校对”酶，并引入了ATP、NADH/NADPH再生系统，使乙酰辅酶A产量提升至38 μM，且无显著副产物积累。瓶颈分析发现延胡索酸还原酶（Frd）活性是限制步骤。研究者巧妙地设计了一个基于二氢乳清酸（Dihydroorotate, DHO）的“Frd旁路”：利用来自克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的I型二氢乳清酸脱氢酶（Dhod1a）和来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的Dhod1b，通过DHO的氧化还原循环驱动延胡索酸还原，从而绕过Frd。在Theta 3.0中应用此旁路后，乙酰辅酶A产量提高了约5倍（~200 μM，60分钟），CO₂固定速率达到2.7 nmol min⁻¹ mg⁻¹核心循环蛋白，与其他合成固碳途径效率相当。
3. 机器学习指导的系统优化（Theta 3.9.9）： 为了充分挖掘Theta循环的潜力，研究者采用了一种名为“Metis”的主动学习引导优化工作流程。该工作流结合实验室自动化（Echo液体处理器），能够在多轮迭代中探索复杂体外系统的组合空间（34个组分，每个组分最多8个浓度），并通过机器学习模型预测改进的组合。在9轮优化中，每轮测试30种不同条件（三重复），最终将最优条件（Theta 3.9.9）下的乙酰辅酶A产量从Theta 3.0的约200 μM提升至约1150 μM（从200 μM底物起始），提高了近5倍，相较于最初的Theta 1.0提升了135倍。关键优化策略包括提高甲基丁烯二酰辅酶C1-辅酶A氧化酶（MCO）浓度，同时降低4-羟基丁酰辅酶A合成酶（Hbs）和辅酶B12的浓度。
4. 循环扩展与产物多样性验证： 为了展示Theta循环作为合成平台的灵活性，研究者对其进行了扩展以生产其他高价值化合物。通过添加一个工程化的丙酰辅酶A羧化酶（PCC*，可接受乙酰辅酶A），成功将循环输出导向丙二酰辅酶A（用于合成聚酮化合物、脂肪酸等），产量进一步提升9%（Theta 3.9.9.mc）。此外，通过用先前优化的乙醛酸循环反应序列替换部分Theta步骤，实现了从CO₂直接合成乙醇酸/乙醛酸（Theta 3.9.9.gc），总转化数超过10。这些实验证明Theta循环是一个稳健且可灵活调整的CO₂固定网络。
第二阶段：Theta循环的模块化体内实施
研究者将完整的Theta循环拆分为三个模块，分别在大肠杆菌中实施，利用宿主的代谢可塑性，并通过生长选择或¹³C标记进行验证。
1. 模块1（丙酮酸→琥珀酸）体内实施： 构建了一个琥珀酰辅酶A营养缺陷型大肠杆菌菌株（SL1），其TCA循环和乙醛酸分流被阻断，无法自身合成琥珀酰辅酶A（合成甲硫氨酸、赖氨酸等必需）。模块1中除Frd外，其余酶均为大肠杆菌固有。通过异源表达布氏锥虫（T. brucei）的NADH依赖型Frd或过表达大肠杆菌自身的L-天冬氨酸氧化酶（Nadb，可在还原延胡索酸的同时氧化天冬氨酸），成功恢复了SL1菌株在不补充琥珀酸盐的最小培养基上的生长，证实了模块1在体内的功能。¹³C标记实验进一步验证了预期的琥珀酸标记模式。
2. 模块2（琥珀酸→巴豆酰辅酶A）体内实施： 使用一个更严格的乙酰辅酶A营养缺陷型菌株（SL2）作为选择平台。设计了一条短的反应序列（C4-乙酰辅酶A分流），用于将模块2的输出物巴豆酰辅酶A转化为乙酰辅酶A。首先验证了该分流与来自铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的巴豆酰辅酶A连接酶（Dmdb1）组合，能使SL2利用巴豆酸生长。随后，构建模块2的五酶系统（来自牙龈卟啉单胞菌P. gingivalis等的优化版本）。将该模块与C4分流同时引入SL2后，初始未能恢复其在琥珀酸上的生长，但通过在平板上进行短期进化筛选，成功分离出能够利用琥珀酸生长的突变菌株（1736和1737）。全基因组测序未发现明确的共有突变，但¹³C标记实验提供了决定性证据：用¹³C标记的琥珀酸喂养这些菌株后，其蛋白质源亮氨酸（合成需要一个乙酰辅酶A和两个丙酮酸）主要显示双标记，而丙氨酸（仅源自丙酮酸）主要未标记，这精确地证明了琥珀酸被成功转化为乙酰辅酶A，即模块2在体内有效运行。
3. 模块3（巴豆酰辅酶A→乙酰辅酶A+丙酮酸）体内实施： 这是最具挑战性的部分。最初尝试将完整的辅酶A依赖路线整合到菌株中未能成功。代谢组学分析发现中间体甲基琥珀酸大量积累，表明大肠杆菌内源硫酯酶（TesB和YciA）水解了关键的中间体(2S)-甲基琥珀酰辅酶A，导致代谢流中断。有趣的是，同时检测到了中康酸，暗示大肠杆菌存在将甲基琥珀酸氧化为中康酸的能力。研究发现，大肠杆菌天然的琥珀酸脱氢酶（Sdh）能以约70%的效率氧化甲基琥珀酸。基于这些发现，研究者重新设计了体内实施策略，放弃了纯辅酶A路线，转而采用“酸旁路”：利用内源硫酯酶将(2S)-甲基琥珀酰辅酶A水解为甲基琥珀酸，再利用内源Sdh将其氧化为中康酸，最后通过来自鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的衣康酸辅酶A转移酶（Ict）将中康酸重新激活为中康酰-C4-辅酶A，接入模块3下游反应。过表达内源Sdh显著提高了中康酸产量。在优化后的菌株背景中，通过¹³C标记实验（使用¹³C标记的葡萄糖和乙酸，提供非标记的巴豆酸），检测到了非标记的丙酮酸生成，这证实了模块3的关键部分在体内能够将巴豆酸衍生的碳流导向中心代谢产物丙酮酸，尽管通量尚不足以完全互补乙酰辅酶A营养缺陷。
四、 主要研究结果
五、 结论与研究意义
本研究成功设计、构建并优化了一条名为Theta循环的新型人工CO₂固定途径，并将其拆分为三个功能模块，分别在大肠杆菌中实现了体内功能。这项工作将已知的氧不敏感体外人工固碳途径数量增加到三条，并为未来在活体中实现和演化这类全新、复杂的固碳系统铺平了道路。
科学价值： 1. 拓展了合成生物学边界：展示了从零设计包含大量正交反应的多酶复杂代谢循环，并将其逐步整合进活体细胞的完整流程，是合成生物学“从设计到实现”能力的重大体现。 2. 提供了研究碳固定演化的新模型：Theta循环作为一个自然界不存在但理论上高效的设计，其体内实施为比较天然与人工固碳途径在活细胞环境下的性能、探索进化压力和限制因素提供了独特的研究平台。 3. 揭示了宿主-途径相互作用的复杂性：模块的体内实施过程生动展示了人工途径与宿主代谢网络之间深刻且动态的相互作用，强调了在代谢工程中考虑宿主背景代谢、酶学副反应及演化潜力的重要性。
应用潜力： 1. 可持续生物制造的潜在平台：Theta循环直接以中心代谢物乙酰辅酶A为输出，而乙酰辅酶A是众多燃料、化学品和材料的前体。高效、可扩展的Theta循环未来有望与可持续能源（如电能、氢气、甲酸）耦合，开发基于CO₂为唯一碳源的生物制造过程。 2. 方法学创新：研究中应用的机器学习引导的体外系统优化工作流（Metis），为快速优化其他复杂多酶系统提供了强大工具。模块化体内实施与进化筛选相结合的策略，也为其他复杂合成途径的移植提供了可借鉴的蓝图。
六、 研究亮点