单细胞RNA测序技术新突破：FX-Cell方法助力攻克植物样本处理难题
作者及发表信息
本研究的通讯作者包括Jia-Wei Wang（中国科学院分子植物科学卓越创新中心）、D. Blaine Marchant（密苏里大学圣路易斯分校）、Brad Nelms（佐治亚大学）和Virginia Walbot（斯坦福大学）等，合作团队来自中美多个研究机构。研究于2025年10月10日在线发表于Nature Methods，标题为《FX-Cell: a method for single-cell RNA sequencing on difficult-to-digest and cryopreserved plant samples》。
学术背景
研究领域与动机
单细胞RNA测序（scRNA-seq, single-cell RNA sequencing）在动物研究中已广泛应用，但在植物领域面临独特挑战：
1. 细胞壁障碍：植物细胞壁（主要成分为纤维素、木质素等）阻碍原生质体（protoplast）的高效释放，尤其对次生壁加厚的组织（如水稻分蘖节、野生稻根茎）难度更大。
2. 样本保存限制：田间样本需即时处理，缺乏实验室设施时难以开展scRNA-seq。
3. 时间敏感性：传统酶解需1–2小时，期间转录组可能因环境刺激（如损伤、病原体）发生改变。
4. 核RNA测序（snRNA-seq）的局限性：核RNA不能完全代表可翻译的mRNA池，且数据质量较低。
研究目标
开发FX-Cell及其衍生方法（FXCryo-Cell、CryoFX-Cell），解决难消化组织和冷冻保存样本的单细胞测序难题，推动植物单细胞图谱的构建。
技术流程与创新方法
1. 样本固定与高温酶解优化
- 样本类型：玉米花药、水稻根尖、野生稻根茎节点等，涵盖单子叶和双子叶植物。
- 固定方法：采用冰乙醇-乙酸（Farmer’s溶液）固定样本，凝固蛋白基质并破坏脂膜，使细胞耐受高温（50°C）酶解。
- 酶解优化：
- 标准酶组合：纤维素酶（cellulase）+ 果胶酶（pectinase）+ 离析酶（macerozyme）。
- 难消化组织：添加蜗牛酶（snailase）靶向几丁质和果胶（图1d），细胞释放效率提升10–364倍（图1c）。
2. RNA酶污染控制
- 挑战：真菌来源的RNase T1/T2污染酶混合物，传统抑制剂无效。
- 解决方案：
- GMP-琼脂糖柱纯化：结合鸟苷单磷酸（GMP）选择性吸附RNase（图1e）。
- 验证方法：盐酸水解后检测248 nm吸光度，柱再生后重复使用8个月仍高效（图1f）。
- 竞争性抑制：添加tRNA和tri-GMP（5′-GMP与2′(3′)-GMP混合物）进一步抑制RNase活性（图2d）。
3. 高通量scRNA-seq流程
- 平台兼容性：优化后适配10x Genomics Chromium平台。
- 水稻根尖实验：消化时间缩短至30分钟，温度降至40°C，双次纯化酶组合使基因检出数中位数达1,661–1,801（图2b）。
- 数据质量：与原生质体法（protoplasting）数据一致性高（图2f），成功注释根冠、韧皮部等细胞类型（图2g）。
4. 冷冻样本处理流程
- FXCryo-Cell：样本先固定后冷冻（-80°C），解冻后酶解，细胞形态和RNA完整性（RIN=6.7）保持良好（图3c）。
- CryoFX-Cell：样本直接冷冻，解冻后固定，适用于田间采样（图3b）。两种方法均捕获6,000–9,000个细胞，基因检出数与新鲜样本相当（图3d–e）。
主要结果与应用
1. 难消化组织的单细胞图谱
- 水稻分蘖节：鉴定出分生组织、韧皮部、木质部等细胞簇，揭示根与分蘖芽的发育关联（图4a）。
- 野生稻根茎节点：发现同时表达茎尖分生组织（如OSH1、OSH15）和根特征基因（如PLT1、PLT2）的细胞群，支持其多向分化潜力（图4b–c）。
2. 田间样本分析
- 玉米冠根：冷冻50天后仍获得9,127个高质量细胞，注释出与温室样本一致的细胞类型（图4d），证实方法适用于自然生长条件研究。
3. 急性损伤响应的单细胞解析
- 拟南芥叶片：FX-Cell避免传统酶解引入的假阳性损伤信号，发现表皮和叶肉细胞特异性响应伤口（图5e）：
- 叶肉细胞：富集茉莉酸（jasmonic acid）代谢和程序性死亡相关基因。
- 表皮细胞：激活钙离子运输通路（图5g）。
结论与价值
科学意义
1. 技术突破：FX-Cell系列方法首次实现难消化植物组织和冷冻样本的高通量scRNA-seq，填补了植物单细胞组学的技术空白。
2. 应用扩展：支持田间样本和急性环境响应的研究，为作物抗逆机制和发育生物学提供新工具。
3. 数据质量：基因检出数优于snRNA-seq，且避免了核RNA的转录组偏差。
亮点
- 方法创新：高温酶解结合固定技术提升细胞释放效率；GMP柱纯化解决RNase污染难题。
- 跨物种适用性：成功应用于水稻、玉米、拟南芥、蕨类等，覆盖单子叶、双子叶和基部被子植物。
局限性与展望
- 液泡发达细胞（如玉米叶肉）易破碎，需进一步优化。
- 微流控平台适配：植物细胞体积大（10–100 μm），建议使用Well-based平台（如BD Rhapsody）。
- 特殊细胞壁成分：需针对不同组织定制酶组合。
未来，FX-Cell与snRNA-seq的联合应用将更全面揭示植物细胞异质性，推动“植物细胞图谱”计划的实现。