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植物激素调控葡萄无籽果实发育的分子机制：GA通过VvSLR1-VvWRKY26级联信号抑制种子石细胞木质素合成

第一作者及单位
本研究由南京农业大学园艺学院的Chen Wang、Xuxian Xuan和Wenran Wang作为共同第一作者完成，通讯作者为Chen Wang（wangchen@njau.edu.cn）和Jinggui Fang（fanggg@njau.edu.cn）。合作单位包括江苏师范大学生命科学学院。研究成果于2025年4月发表在期刊*Plant, Cell & Environment*上（DOI: 10.1111/pce.15570）。

研究背景与目标
葡萄（Vitis vinifera L.）是全球广泛种植的重要水果作物，无籽品种因其食用便利性备受青睐。外源赤霉素（Gibberellin, GA）可诱导葡萄单性结实（parthenocarpy），形成无籽果实，并显著抑制种子石细胞（seed-stone）的木质化发育。然而，GA通过何种分子机制调控石细胞木质素合成尚不明确。
本研究聚焦于microRNA VvmiR397a及其靶基因*VvLAC4*（漆酶基因，laccase）在GA信号通路中的作用。前期研究发现，GA处理可显著上调VvmiR397a表达并抑制*VvLACs*家族基因，但这一调控的级联信号通路尚未解析。本研究旨在揭示GA通过VvSLR1（DELLA蛋白）-VvWRKY26（转录因子）-VvmiR397a-VvLAC4级联信号抑制木质素合成的分子机制，为无籽葡萄育种提供理论依据。

研究方法与流程
1. 实验材料与处理
- 以5年生葡萄品种‘Wink’为材料，在开花前5天（5 dbf）用50 mg·L⁻¹ GA₃处理花序，对照组用水处理。每组设3个生物学重复，每个重复3个花序。取样后液氮速冻保存于-80°C。
- 石蜡切片和半薄切片观察胚珠发育（4-50 daf），组织化学染色（间苯三酚-HCl）检测木质素分布，免疫荧光定位内源GA，LC-MS/MS测定GA含量。

1. 分子机制解析
   
   • 表达模式分析：qRT-PCR检测*VvmiR397a*、*VvLAC4*及*VvWRKY26*在石细胞硬化期（30-50 daf）的表达动态，原位杂交定位其组织特异性表达。
     
   • 靶向验证：通过RLM-RACE和PPM-RACE技术验证VvmiR397a对*VvLAC4*的切割位点；构建*VvmiR397a*过表达载体和靶基因*VvLAC4*的GUS报告系统，通过农杆菌介导的番茄瞬时转化验证靶向关系。
     
   • 启动子分析：克隆*VvmiR397a*启动子片段（P1-P4），通过GUS活性检测和EMSA（电泳迁移率变动实验）鉴定GA响应顺式元件（W-box: TGACTGAC）及VvWRKY26结合特性。
     
   • 蛋白互作：酵母双杂交（Y2H）、GST pull-down、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）验证VvSLR1与VvWRKY26的互作；双荧光素酶报告系统（LUC）分析VvSLR1对VvWRKY26转录活性的抑制效应。
     
   • 功能验证：在烟草中过表达*VvmiR397a*，通过STTM（短串联靶标模拟）技术在葡萄/草莓中沉默*VvmiR397a*，检测木质素含量及*VvLACs*表达变化。

主要研究结果
1. GA抑制石细胞木质化
- GA处理导致葡萄胚珠发育停滞（8 daf出现褐变坏死），最终形成重量仅为正常种子1/1600的败育胚珠（图1）。石蜡切片显示GA处理组胚囊结构异常（图2）。
- 组织化学染色表明，对照组种子石细胞在30-50 daf大量沉积木质素，而GA处理组仅果皮和果柄轻微染色（图3a）。免疫荧光显示内源GA在败育胚珠残留组织中富集（图3b），LC-MS/MS证实其含量显著高于对照组（图3c）。木质素含量测定显示GA处理降低石细胞木质素达60%（图3d）。

1. VvmiR397a-VvLAC4模块的功能

   • qRT-PCR显示，GA处理显著上调*VvmiR397a*并抑制*VvLAC4*（相关系数r=-0.96），原位杂交证实两者在种子内珠被共定位（图4a-f）。
     
   • RACE实验验证VvmiR397a在VvLAC4 mRNA第9-10位核苷酸处切割（图4g），且切割产物在石细胞发育后期减少（图4h）。番茄瞬时表达证实VvmiR397a可特异性抑制VvLAC4-GUS活性（图4i-k）。

2. GA信号级联机制

   • 启动子分析发现*VvmiR397a*含有9个GA响应元件，其中P2片段（含W-box）对GA浓度依赖性响应最强（图5a-c）。系统发育分析显示VvWRKY26与拟南芥AtTTG2同源（图5d），其表达模式与*VvmiR397a*正相关（图5e），且定位于石细胞（图5f-i）。
     
   • Y1H和EMSA证实VvWRKY26特异性结合W-box（图6a-c），双荧光素酶实验显示VvWRKY26激活*VvmiR397a*启动子活性（图6d-e）。
     
   • Y2H、BiFC和Co-IP证明VvSLR1与VvWRKY26互作（图7a-f），且VvSLR1通过竞争性结合抑制VvWRKY26的转录激活功能（图8a-d）。短期GA处理（1-12 h）显示VvSLR1下调而VvWRKY26和*VvmiR397a*上调（图8e-g）。

3. 转基因验证

   • 烟草过表达*VvmiR397a*导致种子变小、木质素减少（图9a-b），*NtLAC4/7/17*表达下降（图9c-d）。STTM沉默葡萄/草莓中*VvmiR397a*后，*VvLAC4*表达回升（图9g-h）。
     
   • 葡萄瞬时转化实验证实*VvmiR397a*过表达降低木质素，而*VvLAC4*过表达逆转此效应（图9i-m）。

结论与意义
本研究首次揭示GA通过“VvSLR1-VvWRKY26-VvmiR397a-VvLAC4”级联信号通路抑制葡萄石细胞木质素合成的分子机制（图10）：
1. 科学价值：阐明了DELLA蛋白（VvSLR1）通过竞争性结合转录因子（VvWRKY26）调控miRNA（VvmiR397a）的分子开关作用，拓展了GA信号转导的调控网络。
2. 应用价值：为无籽葡萄分子设计育种提供了关键靶标基因（如*VvmiR397a*和*VvLAC4*），可通过调控木质素合成改善果实品质。

研究亮点
1. 发现GA通过miR397a-LAC4模块特异性调控木质素合成的物种特异性机制。
2. 开发了基于STTM技术的葡萄miRNA功能研究体系。
3. 整合多组学数据（表达谱、蛋白互作、转基因）验证了GA信号的级联传递路径。

其他价值
研究建立的“启动子片段删除-顺式元件鉴定-转录因子筛选”策略可为其他植物激素响应机制研究提供方法学参考。