本研究由北京师范大学和北京生命科学研究所的丁艳、李俊、杜立林等，以及中国科学院生物物理研究所的江鹤丽、刘超培、许瑞明等研究人员合作完成。论文于2025年1月29日在线发表在《Nucleic Acids Research》期刊上，题为“The ortholog of human DNAJC9 promotes histone H3–H4 degradation and is counteracted by ASF1 in fission yeast”。

学术背景

在真核生物中，组蛋白（Histone）H3–H4是构成核小体的核心组分，其供应必须与DNA复制严密协调，过量或不足都会导致基因组不稳定。组蛋白伴侣ASF1是一种高度保守的蛋白，它结合H3–H4二聚体并参与新合成组蛋白的调控。在酿酒酵母中，ASF1是非必需基因，但在模式生物裂殖酵母中，ASF1却是生存所必需的，这一差异的原因尚不清楚。此外，哺乳动物中的J结构域蛋白DNAJC9能与组蛋白H3–H4相互作用，并参与细胞增殖，但其确切功能长久以来一直未被阐明。一些研究认为DNAJC9可能通过招募Hsp70来保障组蛋白的供应，另有研究则发现DNAJC9与ASF1之间存在功能关联。本研究旨在利用裂殖酵母这一理想的遗传学模型，深入探究DNAJC9同源蛋白的功能及其与ASF1的关系，以期揭示这一保守组蛋白结合蛋白的作用机制。

研究流程与方法

研究团队首先解析了DNAJC9在裂殖酵母中的同源蛋白Djc9的生物学功能。他们通过转座子插入突变进行的“绕过必需性（Bypass-of-Essentiality, BOE）”筛选，鉴定出能够使asf1基因敲除不再致死的抑制因子。随后，为了验证Djc9的缺失能否恢复asf1缺失株的活性，他们进行了酵母四分子孢子解剖分析（Tetrad dissection analysis），并从遗传学上构建并验证了asf1Δ djc9Δ双缺失菌株的存活性。他们还构建了生长素诱导降解子（Auxin-Inducible Degron, AID）标记的asf1-aid菌株以及由四环素诱导型启动子控制的pteto7-djc9菌株，用以精确调控Asf1和Djc9的蛋白表达水平。

接下来，为探究Djc9和Asf1之间的功能关系，研究团队利用AlphaFold-Multimer进行了结构预测，分别构建了Djc9–H3–H4和Asf1–H3–H4的复合物结构模型。他们通过体外GST pull-down实验和Ni-NTA pull-down实验，在纯化蛋白体系中验证了Djc9与组蛋白的直接相互作用及其关键结构域。同时，他们通过位点定向突变，研究了Djc9组蛋白结合界面上关键氨基酸残基（如L129、F132）以及J结构域中HPD基序的功能。为了验证Asf1和Djc9对H3–H4结合是否存在竞争关系，他们设计了体外竞争结合实验，并以不同浓度的纯化Asf1和Djc9蛋白进行剂量依赖性分析。

进一步的，为了在体内证实上述结构预测和体外结果的生理意义，团队利用易错滚环扩增（Error-prone Rolling Circle Amplification）对组蛋白H3–H4进行随机诱变，并在asf1-30温度敏感突变株中筛选能够抑制其生长缺陷的组蛋白突变体，最终鉴定出h3-k122e突变。他们运用免疫印迹（Immunoblotting）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）技术，详尽分析了Djc9与Asf1在竞争结合组蛋白、以及对H3和H4蛋白水平的影响。此外，他们还利用流式细胞术和荧光显微镜，分析了细胞对DNA复制抑制剂羟基脲（Hydroxyurea, HU）的反应，以及特定组蛋白突变体的蛋白稳定性。研究团队还特别检测了蛋白酶体抑制剂硼替佐米（Bortezomib）的作用，以确定Djc9介导的组蛋白降解途径。

主要研究成果与结论

研究结果首先揭示了，在裂殖酵母中，djc9的缺失可以完全挽救asf1缺失导致的致死性。在asf1Δ djc9Δ双缺失背景下，细胞生长与野生型无异。结构生物学和生化实验证实，Djc9和Asf1以互相排斥的方式竞争结合H3–H4二聚体。Asf1通过阻碍Djc9与组蛋白的结合来发挥其生存必需的功能，因为若缺乏Asf1的拮抗，Djc9会以其依赖于Hsp70的J结构域功能的方式，错误地导致大量新生组蛋白H3和H4降解，从而导致细胞死亡。

研究团队筛选到的组蛋白突变体h3-k122e，能特异性地破坏Djc9与H3–H4的结合，而不影响Asf1的结合。表达这个突变体足以绕过asf1的必需性，直接证实了Asf1的核心功能就是拮抗Djc9。研究发现，在Asf1存在时，Djc9的功能转而对细胞有益。当细胞受到DNA复制压力（如HU处理）时，Djc9能特异性地促进多余的新生组蛋白H3和H4的降解。这种降解依赖于Djc9与组蛋白的直接结合，并通过蛋白酶体途径进行。djc9Δ细胞因不能有效清除这些多余的组蛋白而对HU表现出敏感性，减少组蛋白基因的拷贝数则可以挽救这一敏感性。

研究的另一重要发现是，Djc9能保护细胞免受显性负效应（Dominant-negative）组蛋白突变体的毒害。这些与疾病相关的突变体组蛋白（如h3-y41a, h3-l48r）在细胞中累积会具有高度毒性，而Djc9能有效地促进它们的降解，特异性地清除这些功能异常或有潜在危害的蛋白，从而维持组蛋白池的稳态。

研究亮点与价值

这项工作首次明确阐明了保守蛋白DNAJC9/Djc9作为组蛋白H3–H4降解促进因子的确切生化功能，并揭示了其与组蛋白伴侣ASF1在功能上直接拮抗的精细调控机制。研究的最大亮点在于，它不仅解答了ASF1在裂殖酵母中不可或缺的悬念，即其核心功能是抑制Djc9介导的组蛋白降解，更揭示了一个多层次的保护机制：在正常生理状态下，Asf1保护新生组蛋白；在复制应激时，Djc9被调动以清除过量组蛋白；面对突变蛋白威胁时，Djc9又能清除有害组蛋白以维持基因组稳定性。这项研究的科学价值在于，它为理解组蛋白代谢和蛋白质稳态调控网络提供了一个全新的范式，同时也为探索人类DNAJC9相关疾病的发病机理和潜在治疗策略提供了重要的理论基础。