关于PCA/DTPA稳定剂显著提升Chromsystems维生素C检测试剂盒血浆样本储存寿命的研究报告

本研究由来自澳大利亚多所研究机构与医院的科研人员合作完成，主要作者包括Jake T.B. Collie（RMIT大学，皇家病理学家学院质量保证计划维生素咨询委员会）、Elizabeth P. Hudson（杜波医院，墨尔本大学）、Adam M. Deane（墨尔本大学，皇家墨尔本医院）、Rinaldo Bellomo（墨尔本大学，皇家墨尔本医院，奥斯汀健康中心）以及Ronda F. Greaves（RMIT大学，皇家病理学家学院质量保证计划维生素咨询委员会，默多克儿童研究所，墨尔本大学）。该研究以题为“A stabilizing agent, PCA/DTPA, improves plasma storage life for the Chromsystems vitamin C assay up to six months”的简报形式，于2021年发表在学术期刊《Annals of Laboratory Medicine》（Ann Lab Med）上。

一、 研究学术背景

本研究属于临床化学与检验医学领域，聚焦于生物样本前处理与分析的标准化及质量改进。具体而言，研究关注的是维生素C（抗坏血酸，ascorbate）在血浆样本中的稳定性问题及其对检测结果准确性的影响。

研究背景基于几个关键事实：首先，维生素C，特别是其在危重症护理中的应用价值，近年来重新受到广泛关注，导致对其准确测量的需求增加。其次，根据澳大利亚皇家病理学家学院质量保证计划（RCPAQAP）的数据，由德国Chromsystems公司提供的商业检测试剂盒是测量血清或血浆中抗坏血酸最广泛使用的方法。该试剂盒采用高效液相色谱-紫外检测法。然而，该试剂盒说明书指出，血浆样本在-20°C下的储存寿命仅为五天。这对于需要长时间收集样本并进行批量分析的随机对照试验，或在偏远地区采集样本后需长途运输的情况而言，储存期过短，构成了实际应用的重大限制。

此前，已有研究通过使用稳定剂（如酸和金属螯合剂）来最小化抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，或通过将脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸，以改善样本稳定性。但这些研究多使用内部建立的检测方法进行验证。目前，缺乏证据支持将这些样本处理程序应用于广泛使用的Chromsystems商业试剂盒。因此，本研究旨在解决两个核心问题：第一，在样本处理过程中加入稳定剂是否与Chromsystems商业试剂盒兼容？第二，如果兼容，能否将血浆抗坏血酸的稳定储存期延长至制造商推荐的五天以上？

二、 研究详细工作流程

本研究嵌套于一项名为“维生素C、氢化可的松和硫胺素治疗感染性休克患者（VITAMINS）”的随机对照试验中，历时18个月。研究设计严谨，包含三个核心实验，以系统评估稳定剂的效果和样本的长期稳定性。

研究对象与样本处理： 研究使用来自危重症患者的锂肝素抗凝血浆样本。血液采集后，在4°C下以1,431×g离心10分钟分离血浆。随后，每份样本的血浆被分装到多个微量离心管中，并接受两种不同的处理流程： 1. 非稳定化血浆组： 血浆分装后立即置于-80°C超低温冰箱中储存。 2. PCA/DTPA稳定化血浆组： 在血浆分装后、储存前，立即按1:1的体积比加入PCA/DTPA稳定剂，然后置于-80°C储存。

稳定剂选择与制备： 研究选择使用高氯酸（Perchloric acid, PCA）和二乙烯三胺五乙酸（Diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA）的混合液作为稳定剂，基于先前研究证明其能有效最小化抗坏血酸氧化。PCA/DTPA溶液的配制浓度为0.54 M，储存于4°C备用。选择-80°C而非试剂盒推荐的-20°C作为储存温度，是基于文献报道，高于-75°C的温度可能导致非稳定化血浆氧化速率更高，且使用酸稳定剂和金属螯合剂的研究通常也采用-80°C储存。

检测方法与质量控制： 所有血浆样本的抗坏血酸浓度均使用Chromsystems试剂盒，在岛津高效液相色谱-紫外检测系统上进行测定。为确保检测性能的可靠性，研究采取了严格的质量控制措施：每批分析均包含两个水平的内部质量控制品；同时，实验室参加了RCPAQAP的血浆维生素C外部质量保证计划。研究中内部质量控制品的平均变异系数为9.6%，外部质量保证计划的变异系数为3.9%。研究采用RCPAQAP基于生物学变异研究设定的允许性能规格作为判断结果差异是否显著的依据。

三个核心实验流程： 1. 非稳定化血浆储存实验（稳定性评估）： 共纳入39份非稳定化血浆样本。首先测定其基线浓度，然后将重复样本在-80°C下分别储存2、7、15或26周（±1周）后再次进行测定。通过比较储存后与基线浓度的差异，评估在无稳定剂情况下，仅靠超低温储存能否维持抗坏血酸稳定性。 2. PCA/DTPA稳定化血浆储存实验（稳定性评估）： 共纳入42份PCA/DTPA稳定化血浆样本。实验设计与实验一完全相同，目的是评估加入稳定剂后，血浆在-80°C下长期储存的稳定性。 3. 非稳定化与稳定化血浆对比实验（稳定剂效果评估）： 直接比较来自同一原始样本的、配对处理的非稳定化血浆和PCA/DTPA稳定化血浆中的抗坏血酸浓度。样本同样在-80°C下储存2、7、15或26周后进行分析。此实验旨在量化PCA/DTPA在样本处理阶段防止氧化的实际效果。

数据分析方法： 使用Microsoft Excel、Analyse-it和MedLabQC软件进行统计分析。采用配对双尾t检验、Passing-Bablok回归分析和差异图来分析数据。显著性判断标准为：P ≤ 0.05，差异图的95%置信区间不包含零，或Passing-Bablok回归斜率的95%置信区间不包含1.00。

三、 研究主要结果

1. 长期储存稳定性结果： 无论是非稳定化血浆还是PCA/DTPA稳定化血浆，在-80°C下储存长达六个月（26周），其抗坏血酸浓度均未发生显著变化。

   • 非稳定化血浆组： 储存后与基线浓度相比无显著差异，平均百分比差异仅为+1.2%。差异图显示估计偏差为-0.1 µmol/L，且所有数据点均落在允许性能规格范围内。
   • PCA/DTPA稳定化血浆组： 储存后与基线浓度相比也无显著差异，平均百分比差异为-0.2%。差异图显示估计偏差为5.7 µmol/L，所有数据点同样在允许性能规格范围内。
   • 结果解读： 这一结果表明，将血浆储存在-80°C的超低温环境下，本身就能有效阻止抗坏血酸的进一步氧化，因此即使不加稳定剂，分析物浓度在储存期间也能保持稳定。对于加入稳定剂的样本，由于氧化过程被抑制，浓度在整个研究期间得以维持。

2. 稳定剂效果对比结果： 这是本研究最关键的发现在于，配对比较显示，PCA/DTPA稳定化血浆中的抗坏血酸浓度显著高于配对的非稳定化血浆，平均绝对差值为27 µmol/L，平均百分比差值为11%。

   • 统计显著性： 配对t检验显示P=0.01。差异图中多个数据点超出了允许性能规格的界限。Passing-Bablok回归分析显示斜率为1.11，其95%置信区间为1.02–1.29，不包含1.00，表明存在11%的比例性差异。
   • 结果解读与逻辑关联： 由于Chromsystems试剂盒仅检测抗坏血酸（而非其氧化产物脱氢抗坏血酸），观察到的差异很可能源于PCA/DTPA在样本处理阶段（即从血液采集、离心、分装到加入稳定剂或冷冻前的阶段）最小化了抗坏血酸的氧化。因此，稳定化血浆维持了更高的抗坏血酸浓度。这一发现将样本处理过程（而不仅仅是储存条件）确定为导致分析物损失的关键环节。它解释了为什么尽管长期储存实验显示两者都稳定，但直接对比时浓度存在差异——非稳定化血浆在达到冷冻状态前的处理过程中已经发生了氧化损失，导致其基线浓度（即T0）本身就已经是被低估的。

3. 兼容性确认： 在分析前，将PCA/DTPA用去离子水稀释后作为空白样本进样，确认其色谱图无干扰峰。结合所有使用稳定化血浆的样本均能成功进行检测并获得可靠结果，证明PCA/DTPA稳定剂与Chromsystems试剂盒的分析系统是兼容的。

四、 研究结论与价值

本研究得出以下明确结论： 1. 使用PCA/DTPA作为稳定剂与Chromsystems维生素C检测试剂盒完全兼容。 2. 在血浆样本处理阶段添加PCA/DTPA，能显著减少抗坏血酸在处理过程中的氧化，从而获得更准确、更高的检测结果。 3. 无论是添加了PCA/DTPA还是未添加的血浆，在-80°C下储存时，抗坏血酸浓度均可稳定保持长达六个月，这远远超过了制造商推荐的五天（-20°C储存）有效期。

科学价值与应用价值： * 方法学验证与优化： 本研究首次为广泛使用的Chromsystems商业试剂盒提供了一种经验证的、可显著提高样本稳定性和结果准确性的前处理方法。它将学术界已有的稳定剂知识成功转化并整合到主流商业检测平台的工作流程中。 * 解决实际应用瓶颈： 将血浆样本的有效储存期从5天延长至6个月，极大地缓解了多中心临床试验、流行病学研究、偏远地区样本采集和运输以及实验室批量分析所面临的时间压力，提高了研究的可行性和样本利用率。 * 明确关键控制点： 研究强调了样本处理阶段（室温或低温离心、分装等操作过程）是抗坏血酸损失的主要环节，而不仅仅是储存温度。这为实验室制定标准操作程序提供了关键依据。 * 临床与科研意义： 对于使用该试剂盒的常规病理实验室和涉及维生素C干预的随机对照试验，采用本研究推荐的方法可以确保检测结果的准确性、可比性和长期稳定性，有利于建立更可靠的生物样本库和获得高质量的研究数据。

五、 研究亮点

1. 重要的发现： 揭示了对于Chromsystems维生素C检测，样本在处理过程中的氧化是导致结果低估的主要因素，而不仅仅是储存条件。PCA/DTPA稳定剂主要是在这个阶段发挥作用。
2. 方法的新颖性与实用性： 研究并非开发新检测方法，而是聚焦于优化现有主流商业试剂盒的样本前处理流程，这是一种具有高实用价值和可推广性的研究思路。它成功地将一种有效的稳定剂方案与一个特定的、广泛使用的商业检测系统进行了“嫁接”和验证。
3. 研究设计的针对性： 研究直接针对制造商说明书的局限性（5天储存期）和临床研究/实验室的实际需求（长期、批量分析）展开，目标明确。实验设计包含了储存稳定性、稳定剂效果和兼容性验证等多个层面，逻辑严密。
4. 临床相关性： 研究直接使用危重症患者的真实血浆样本，其结果更能反映该检测方法在目标患者群体中的实际应用场景和临床效用。

六、 其他有价值的内容

研究也坦诚地指出了其局限性：由于样本量相对较小，研究仅评估了一种稳定剂（PCA/DTPA）和一种储存温度（-80°C）。作者建议未来研究可以评估更多的时间点、其他类型的稳定剂或还原剂、以及不同的储存温度。此外，进行为期1-2年的更长期稳定性研究，对于建立用于未来临床研究的样本生物库将大有裨益。

基于全部结果，作者最终建议：对于使用Chromsystems试剂盒进行血浆抗坏血酸分析的实验室，应在样本处理过程中加入PCA/DTPA稳定剂，并将血浆储存于-80°C。这一组合策略能最大程度保证分析物的稳定性与检测结果的准确性。