本文档是一项原创性研究。以下是针对此研究的学术报告。
本研究报告旨在向中文读者介绍由Joeri Bordes、Thomas Bajaj、Lucas Miranda 等共同完成，并由Mathias V. Schmidt 作为通讯作者领导的研究。该研究发表于Communications Biology期刊，在线发表日期为2024年。
本研究由德国马克斯·普朗克精神病学研究所（Max Planck Institute of Psychiatry）的神经应激恢复力研究组主导，联合了波恩大学医院精神病学与心理治疗系神经稳态研究组、马克斯普朗克精神病学研究所统计遗传学研究组、慕尼黑工业大学巴伐利亚生物分子质谱中心等多个机构的研究人员共同完成。研究成果以题为《早期生命应激后的性别特异性恐惧获得与杏仁核和海马嘌呤和谷氨酸代谢相关》的论文形式，于2024年在线发表于自然（Nature）出版集团旗下的开放获取期刊Communications Biology。
本研究隶属于神经科学与精神疾病机制领域，特别是关注早期生命应激（Early Life Stress, ELS）如何通过影响神经生物学通路，增加个体成年后罹患创伤后应激障碍（Post-traumatic Stress Disorder, PTSD）等压力相关疾病的风险。一个关键的临床现象是，PTSD在女性中的患病率（约11.0%）约为男性（约5.4%）的两倍，且这种差异无法完全归因于创伤事件类型或严重程度的不同，提示存在潜在的生物学机制。
已知ELS（如儿童虐待或忽视）会导致持久的神经内分泌功能改变和大脑结构变化，增加PTSD风险。先前的人类遗传学研究表明，压力相关障碍部分由基因变异介导，其中糖皮质激素受体共伴侣蛋白FKBP51（由FKBP5基因编码）扮演着重要角色。同时，动物模型证据表明，ELS对啮齿类动物的影响存在性别差异。大脑中负责恐惧和压力处理的关键区域，特别是基底外侧杏仁核（basolateral amygdala, BLA）和海马（hippocampus, Hip），在出生后早期持续发育，且高表达糖皮质激素受体和盐皮质激素受体，因此对ELS的影响尤其敏感。这些区域也是恐惧记忆形成的关键脑区。
尽管有证据表明ELS会以性别特异性的方式影响恐惧行为，但其背后的神经生物学机制，尤其是在关键脑区的细胞代谢层面，仍未得到充分阐释。代谢组学作为分析细胞过程终产物的工具，能够反映潜在的疾病状态，为探索ELS的性别依赖性影响机制提供了新视角。然而，在特定应激相关脑区（如BLA和Hip）探索代谢及其调控通路与ELS关系的研究尚属空白。
因此，本研究的主要目的在于：利用有限垫料和筑巢（Limited Bedding and Nesting, LBN）范式模拟ELS，系统性研究其在性别特异性层面对以下三方面的影响：1）FKBP5基因表达；2）特定脑区（BLA、背侧海马dHip、腹侧海马vHip）的代谢组学；3）恐惧记忆的获得与提取。研究旨在揭示应激反应基因、代谢通路与恐惧记忆形成的神经生物学底物之间复杂的相互作用，为理解压力相关疾病的性别差异提供新见解。
本研究设计严谨，包含动物模型建立、行为学测试、基因表达分析和代谢组学分析等多个相互关联的步骤。
1. 实验动物与ELS模型建立： - 研究对象：使用C57BL/6N小鼠。亲代（F0）用于繁殖，其子代（F1）作为实验动物。 - ELS建模：采用成熟的LBN范式诱导慢性早期应激。在产后第2天（P02）至第9天（P09），将母鼠和幼鼠置于垫料和筑巢材料严重受限的笼具中，以模拟早期不良环境。对照组（NS）则提供充足材料。 - 样本量：在成年期（3月龄）进行行为学和分子分析的动物，雌性NS和LBN组各10只，雄性NS组11只，LBN组11只。部分生理指标测量在P09幼鼠中进行，样本量略有不同。
2. 成年期行为学测试： - 测试内容：所有动物在3月龄时接受恐惧条件化测试，流程持续3天：第1天为恐惧获得（Fear Acquisition），第2天为情景恐惧记忆提取，第3天为听觉恐惧记忆提取。 - 恐惧获得范式：采用5次“条件刺激（声音）-非条件刺激（电击）”配对，以最大化恐惧行为输出。使用Any-Maze软件记录和分析僵直行为（freezing）的时间百分比。
3. 行为数据的无监督深度分析： - 方法创新：这是本研究的一大亮点。为了超越传统僵直行为的分析，捕捉更广泛的、可能具有性别和应激特异性的行为模式，研究者开发并应用了一套无监督深度表型分析流程。 - 姿态估计：首先，使用开源软件DeepLabCut（v2.2b7）对恐惧获得阶段的原始视频进行无标记姿态估计，标注包括鼻子、耳朵、脊柱点、四肢和尾根在内的11个身体部位。 - 无监督聚类：随后，使用研究者团队自主开发的Python软件包DeepOF（v0.2）处理DeepLabCut的标注数据。DeepOF对坐标进行旋转对齐和居中预处理，然后应用其变分深度嵌入模型对雄性和雌性数据（统一模型）进行无监督聚类分析，旨在识别自然涌现的行为“音节”或模式。通过可视化高分（置信度≥0.9）聚类代表的视频片段，并结合SHAP（Shapley Additive Explanations）值进行特征重要性分析，来解释每个聚类所代表的行为类型（如探索、僵直、蜷缩等）。
4. 基因表达分析： - 脑区与指标：在P09（应激刚结束）和成年期（P56），分别取脑，通过放射性原位杂交技术检测FKBP5 mRNA在BLA和背侧海马各亚区（CA1, CA2-3, 齿状回DG）的表达水平。
5. 代谢组学分析： - 样本收集：成年动物在行为测试后，快速取脑并冷冻。使用冷冻切片机制备250微米冠状切片，并用组织打孔器精准采集BLA、dHip和vHip的脑组织样本。 - 代谢物提取与分析：提取组织中的极性代谢物，采用亲水相互作用色谱-质谱联用（HILIC-MS）技术进行非靶向代谢组学分析。数据已公开共享。 - 数据分析流程： a. 差异代谢物筛选：分别比较性别（雄vs雌）、应激条件（LBN vs NS）以及“性别×应激条件”交互作用在三个脑区中的代谢物差异。 b. 通路富集分析：对筛选出的差异代谢物集合进行代谢物集富集分析（Metabolite Set Enrichment Analysis, MSEA），以确定哪些生物学代谢通路受到显著影响。
6. 统计与可重复性： - 使用R和Python进行统计分析。数据首先检验正态性和方差齐性，根据情况选用参数检验（如t检验、重复测量方差分析）或非参数检验（如Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis检验）。多重比较校正采用Bonferroni法。p < 0.05视为显著。
1. LBN应激的生理学特征呈现性别与时间依赖性： - 体重：P09时，LBN暴露显著降低了雄性和雌性幼鼠的体重，表明应激模型成功。至成年期（3月龄），雌性LBN小鼠的体重降低仍然持续，而雄性则恢复至对照水平。 - 肾上腺重量与皮质酮：成年期，LBN雄性的相对肾上腺重量显著增加，而雌性无变化。在P09，LBN雌性幼鼠的基线皮质酮水平显著升高，雄性则无变化；至成年期，两性基线皮质酮均无组间差异。这些结果表明，LBN对下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响具有性别和时间依赖性：急性效应（P09皮质酮升高）在雌性中更明显，而长期效应（成年期肾上腺重量增加）在雄性中更显著。
2. FKBP5基因表达在雄性背侧海马CA1区特异性上调： - 在P09，两性的BLA和海马各亚区FKBP5表达均未因LBN而发生显著变化。 - 在成年期，LBN暴露导致雄性小鼠背侧海马CA1区的FKBP5 mRNA表达显著上调，而在雌性中或在BLA、CA2-3、DG区均未观察到应激诱导的变化。这提示ELS的长期分子效应在海马具有性别和亚区特异性。
3. 恐惧行为受LBN影响，且存在性别特异性模式： - 传统僵直分析： - 恐惧获得：LBN雄性在声音呈现期间（Tones 2-5）的平均僵直行为显著降低；LBN雌性则在声音间隔期（ITIs）的平均僵直行为显著降低。 - 恐惧提取：LBN雄性和雌性在情景恐惧记忆提取中的僵直均显著降低。在听觉恐惧记忆提取中，仅LBN雄性表现出僵直降低，雌性无差异。 - 无监督深度行为分析（核心发现之一）： - 对恐惧获得阶段（Tones 2-5）的行为进行无监督聚类，得到9个行为簇。 - 在雌性中，簇0（Cluster 0）在LBN组中比例显著增加，而簇6（Cluster 6）比例显著降低。在雄性中，无显著变化。 - 通过SHAP分析和视频观察对簇进行解释： - 簇0的特征是：速度增加、蜷缩行为减少、脊柱伸展。该行为被解释为主动恐惧反应，类似于大鼠中描述的“疾跑”（darting），表现为对环境探索的快速移动。 - 簇6的特征是：脊柱伸展减少、蜷缩行为增加、头部表面积减小。该行为被解释为典型的被动恐惧反应（僵直），动物常静止不动。 - 结论：LBN暴露特异性地改变了雌性小鼠在恐惧获得期的行为策略，使其表现出更多的主动恐惧行为和更少的被动僵直行为，而雄性主要表现为僵直程度的普遍降低。
4. 脑代谢组学揭示性别与应激依赖的嘌呤和谷氨酸代谢改变： - 总体模式：无论在BLA、dHip还是vHip，性别（雄 vs 雌）是导致代谢物差异的最主要因素，而仅比较应激条件（LBN vs NS）时，差异代谢物很少。这表明大脑基础代谢状态存在显著的性别二态性。 - 通路富集分析（核心发现之二）： - 嘌呤代谢：在所有三个脑区（BLA, dHip, vHip）中，无论是对照组还是LBN组，雄性 vs 雌性的比较都显示出嘌呤代谢通路的显著富集。这意味着两性在基础嘌呤代谢上存在固有差异，且不受LBN应激的显著改变。 - 嘧啶代谢：仅在BLA中，LBN条件下的雄性 vs 雌性比较显示嘧啶代谢通路显著富集，而在对照组中不显著。 - 谷氨酸代谢：发现了应激条件与性别的交互作用。 - 在BLA中，“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”通路在对照组的雄性 vs 雌性比较中显著富集，但在LBN组的雄性 vs 雌性比较中不显著。提示LBN可能以相似的方式改变了雄性和雌性BLA的谷氨酸代谢，抹平了两性间的基础差异。 - 在vHip中，“精氨酸生物合成”（与谷氨酸代谢相关）通路在LBN组的雄性 vs 雌性比较中显著富集，而在对照组中不显著。提示LBN在腹侧海马引入了新的性别差异性代谢改变。
本研究系统性地揭示了早期生命应激（LBN）在多维度上具有显著的性别特异性影响：
科学价值与应用前景： - 理论价值：本研究将应激生理学、行为表型、基因表达和细胞代谢组学在性别维度上进行了整合，为理解ELS如何通过改变特定脑区的代谢状态来程序化性别差异性的恐惧行为和PTSD易感性，提供了一个新颖且多层次的理论框架。它强调了在研究压力相关障碍时，必须考虑性别特异性的代谢改变。 - 方法学创新：应用并展示了无监督深度行为分析（DeepOF）在揭示复杂、非僵直恐惧行为方面的强大能力。这种方法不依赖于研究者的先验假设，能够“数据驱动”地发现新的行为特征（如本研究的“簇0”），是未来神经行为学研究的重要工具。 - 转化医学意义：研究结果指出了嘌呤和谷氨酸代谢通路作为干预靶点的潜力。针对这些通路开发性别特异性的治疗策略（如药物或代谢调节剂），可能为预防或治疗由早期逆境导致的、具有性别差异的应激相关精神疾病（如PTSD）提供新途径。