天然低共熔溶剂用于高效酶法合成甘油二酯的积极影响研究

一、 研究团队、期刊与发表时间 本研究的主要作者为Duan Zhou（第一作者），以及通讯作者Daoming Li*和共同通讯作者Mouming Zhao**。研究团队主要来自陕西科技大学食品科学与工程学院（School of Food Science and Engineering, Shaanxi University of Science and Technology）和华南理工大学食品科学与工程学院（School of Food Science and Engineering, South China University of Technology）。这项研究成果以题为“Insights into the multiple positive effects of natural deep eutectic solvents for highly efficient synthesis of diacylglycerol through enzymatic esterification”的研究论文形式，发表于Elsevier旗下的学术期刊 *Molecular Catalysis*，卷581，文章编号115164，在线发表于2025年4月28日，收录日期为2025年2月19日，最终修订于2025年4月11日。

二、 研究的学术背景 本研究属于食品科学、生物催化与绿色化学交叉领域。研究的核心目标是开发一种高效、绿色的甘油二酯（Diacylglycerol， DAG）合成方法。DAG，特别是其稳定异构体1,3-二酰基甘油，因其在代谢上不同于甘油三酯（能通过门静脉直接进入肝脏氧化供能，而非重新酯化为脂肪储存），具有抗肥胖、促进心血管健康等多种健康益处，同时其兼具亲水羟基和疏水脂肪酸链的两亲性也使其在食品、制药和化妆品工业中作为乳化剂和稳定剂具有广泛应用。然而，天然油脂中DAG含量通常低于5%，无法满足工业需求。

目前，酶法酯化是工业合成DAG的常用方法，具有条件温和、环境友好等优点，但也存在局限性：反应产生的水分会引起逆反应（水解），降低目标产物含量；脂肪酸与甘油互溶性差，导致初始反应速率低；以及适用于DAG合成的1,3-位置选择性强的脂肪酶种类有限。

随着绿色化学的发展，天然低共熔溶剂（Natural Deep Eutectic Solvents， NADES）作为一种新兴的绿色反应介质，展现出高热稳定性、高安全性、良好的生物相容性和优异的溶解能力，在酶催化反应中显示出潜力。先前研究表明，氯化胆碱：甘油（ChCl:Gly）等NADES有助于酶法制备DAG，但报道的DAG产率仍普遍较低（<50%），且NADES能提升DAG选择性的原因尚不明确。因此，本研究的目的是：1）建立一种在NADES中高效合成DAG的酶法酯化新方法；2）阐明NADES对提高DAG产率和选择性的多重积极效应。

三、 详细的研究流程与方法 本研究包含一个系统的工作流程，涵盖了筛选、优化和机理探究三个阶段，共七个主要步骤。

步骤一：NADES的制备与表征。 研究团队首先制备了10种基于氯化胆碱（ChCl）和甜菜碱（Betaine）作为氢键受体（HBA），甘油（Gly）、尿素（U）、木糖醇（X）、柠檬酸（CA）、葡萄糖（Glc）和水作为氢键供体（HBD）的NADES。采用加热搅拌法，将预先脱水的组分按特定摩尔比混合，在80°C、200 rpm下搅拌2小时，直至形成均一液体。随后测定了所有NADES在25°C下的密度及在30-70°C范围内的粘度。这是理解后续反应传质和效率差异的基础。

步骤二：固定化脂肪酶的筛选。 研究旨在寻找最适配NADES体系的脂肪酶。研究选取了三种常用于DAG合成的商业化固定化脂肪酶：Novozym 435（南极假丝酵母脂肪酶B，载体为大孔树脂）、Lipozyme 435（同源脂肪酶，不同产品）和Lipozyme RM IM（米黑根毛霉脂肪酶，载体为阴离子交换树脂）。评价实验在10种不同的NADES中进行，固定反应条件（底物摩尔比、温度、酶用量、时间），以油酸转化率、DAG和单甘酯（MAG）含量为指标，比较三种酶的催化性能。

步骤三：NADES的筛选。 基于上一步筛选出的最佳脂肪酶，在10种不同的NADES以及无溶剂体系（对照组）中催化油酸与甘油的酯化反应。通过监测不同时间点的油酸转化率和反应6小时后的产物组成（DAG、MAG、TAG含量），评估不同NADES对DAG合成效率的影响，筛选出最有利于提高DAG含量的NADES体系。

步骤四：反应条件的优化。 针对筛选出的最优脂肪酶-NADES组合，系统优化了酯化反应的关键参数。实验采用单变量法，依次考察了底物摩尔比（油酸：甘油，从1:1到1:5）、反应温度（30°C至70°C）、酶用量（占总底物质量的2 wt%至10 wt%）和反应时间（1至24小时）对油酸转化率、DAG含量以及1,3-DAG选择性的影响，以确定最佳反应条件。

步骤五：热力学分析。 为了从动力学角度理解反应选择性，研究在最佳反应条件下，考察了不同温度（30-70°C）对初始反应速率的影响。初始反应速率定义为油酸转化率低于5%时的油酸消耗、DAG生成和MAG生成的速率。通过构建初始反应速率对数与绝对温度倒数（1/T）的阿伦尼乌斯（Arrhenius）曲线，计算了油酸转化、DAG生成和MAG生成的表观活化能。

步骤六：水活度研究。 为了探究NADES如何应对酯化反应中生成的水，研究比较了在最优NADES体系（ChCl:Gly）和无溶剂体系中，随着反应时间延长，反应体系水活度的变化。在特定时间点取样，分离出富含甘油的相（无溶剂体系）或含有甘油的NADES相（ChCl:Gly体系），使用水活度仪进行测定。

步骤七：反应界面观察。 为了验证NADES能否增加反应界面，从而促进传质和反应，研究采用激光共聚焦显微镜观察了大豆油在水以及不同浓度ChCl:Gly水溶液中的微观分布形态。通过尼罗红和尼罗蓝混合荧光染料对油相和水相/NADES相进行染色，直观比较了油滴的尺寸和分散均匀度。

数据分析： 所有实验均进行三次平行，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 26.0软件进行数据处理和分析，显著性水平设定为p < 0.05。产物分析采用配备示差折光检测器的高效液相色谱法，通过标准品比对进行定性，通过校准曲线进行定量分析。

四、 主要研究结果及其逻辑关系 1. 酶与NADES的筛选结果： 研究发现，三种脂肪酶中，Novozym 435在大多数NADES中表现出最高的油酸转化率和DAG生成量，同时副产物MAG含量最低，因此被选为最适催化剂。在10种NADES中，ChCl:Gly (1:2)体系在反应6小时后，能产生最高的DAG含量（66.42 wt%）和最低的MAG含量，且油酸转化率高达90.31%，显著优于无溶剂体系（DAG含量约46%）。这确立了Novozym 435与ChCl:Gly为最优组合，为后续优化和机理研究奠定了基础。

2. 条件优化结果： 通过系统优化，确定最佳反应条件为：油酸与甘油摩尔比1:4，反应温度50°C，Novozym 435用量为底物总质量的4 wt%，反应时间7小时。在此条件下，DAG含量达到最高的67.08 wt%（产率67.45%），且副产物TAG和MAG含量相对较低。值得注意的是，最佳反应温度（50°C）显著低于以往在ChCl:Gly中通过甘油解法制备DAG的报告温度（80°C），这有利于降低工业生产的能耗成本。

3. 热力学分析结果： 阿伦尼乌斯曲线显示，DAG生成的活化能为55.36 kJ/mol，而MAG生成的活化能更高，为62.60 kJ/mol。这表明在ChCl:Gly体系中，生成DAG所需克服的能垒更低，反应在动力学上更倾向于生成DAG而非MAG。这一结果从能量角度直接解释了为何该体系能获得高DAG选择性。

4. 水活度研究结果： 监测发现，在无溶剂体系中，随着反应进行，生成的水导致体系水活度从0.083持续上升至0.181。然而，在ChCl:Gly体系中，水活度始终维持在较低水平（≤0.1），并未显著升高。这证明ChCl:Gly体系具有吸收反应生成水的能力。其机理是水分子可以作为氢键供体或受体，整合到NADES的氢键网络结构中。这一特性有效抑制了由水引起的酰基甘油逆水解反应，推动酯化平衡正向移动，从而有利于DAG的积累。同时，由于体系始终能保持两相分离（油相和NADES相），也简化了产物的后续分离。

5. 反应界面观察结果： 激光共聚焦图像清晰显示，大豆油在纯水中形成的油滴较大且分布不均；而在含有ChCl:Gly的水溶液中，油滴尺寸显著变小，分布更加均匀致密，且ChCl:Gly浓度越高，这种乳化分散效果越明显。这直观证明了ChCl:Gly具有表面活性剂功能，能有效增大油相（底物油酸）与亲水相（甘油/NADES）之间的接触界面面积。界面增大意味着脂肪酶（作为一种界面酶）的作用位点增加，底物传质加快，从而提高了反应速率和转化率。

结果间的逻辑关系： 筛选和优化实验确立了高效合成DAG的“术”（方法）。后续的热力学、水活度和界面研究则揭示了其“道”（机理）。热力学数据解释了反应内在的选择性趋势；水活度数据解释了体系如何克服水抑制的难题；界面观察则解释了为何NADES体系在粘度高于无溶剂体系的情况下，仍能实现高转化率。这三者共同构成了NADES提升DAG合成效率的完整机理链条：降低DAG生成的能垒（动力学优势）、原位吸收反应水（热力学推动）、以及增大反应界面（传质促进）。

五、 研究结论与意义 结论： 本研究成功开发了一种在天然低共熔溶剂ChCl:Gly中，利用Novozym 435催化油酸与甘油酯化高效合成DAG的新方法。在优化条件下，DAG含量高达67.08 wt%，显著优于现有文献报道。研究从多角度阐明了ChCl:Gly体系的多重积极效应：1）通过降低DAG生成的活化能，使反应动力学更利于DAG形成；2）通过其氢键网络吸收反应生成的水，维持低水活度，抑制逆反应，推动平衡向酯化方向移动；3）通过其表面活性作用，增加油-亲水相界面面积，促进传质和酶催化。

意义与价值： * 科学价值： 本研究超越了简单的工艺优化，深入探究了NADES在酶促酯化反应中的多重作用机制，为“溶剂工程”调控酶催化反应的选择性和效率提供了新的理论见解和实验证据。特别是将热力学、水活度控制和界面效应相结合的系统性机理解释，具有重要参考价值。 * 应用价值： 所建立的方法具有高效、条件温和（50°C）、无需额外脱水步骤、使用绿色溶剂等优点，为DAG的工业化酶法生产提供了更具经济性和环保性的可行方案。高产物含量也降低了后续分离纯化的难度和成本。 * 指导意义： 研究结果为利用NADES设计其他高附加值脂类化合物的高效生物合成路径提供了实践指南和理论依据。

六、 研究亮点 1. 高合成效率： 实现了目前文献报道中酶法酯化合成的DAG最高含量之一（67.08 wt%），方法具有显著优越性。 2. 机理阐释深入且系统： 首次在同一研究中，从热力学（活化能）、水活度控制、物理界面三个维度，完整揭示了NADES提升酶法合成DAG选择性和产率的协同作用机制，形成了逻辑闭环。 3. 绿色与实用性强： 采用全天然组分构成的NADES作为反应介质，符合绿色化学原则。最佳反应温度较低，且NADES自身具备吸水功能，省去了传统脱水设备或添加剂，简化了工艺，降低了能耗和成本。 4. 研究设计系统完整： 从溶剂与酶的筛选，到反应条件的逐项优化，再到多角度的机理验证，研究设计层层递进，逻辑严谨，数据支撑充分。

七、 其他有价值内容 研究在讨论部分也指出了未来的探索方向：尽管通过分子动力学模拟推测ChCl:Gly可能提高了脂肪酶的sn-1,3位置选择性，但NADES与脂肪酶在分子水平上的相互作用如何影响酶与底物的结合，从而改变其区域选择性，仍需进一步深入研究。这为后续在分子模拟和结构生物学层面的探索指明了课题。

本研究由西安市农业技术研发项目、陕西省重点研发计划、陕西省教育厅科研计划和国家自然科学基金共同资助。