大柴胡汤（da-chai-hu decoction，DCHD）通过整合代谢组学与网络药理学预防糖尿病小鼠肾损伤的研究报告
一、作者与发表信息
该研究由广东药科大学（Guangdong Pharmaceutical University）的王雪（Xue Wang）、陈鹏飞（Peng-fei Chen）、邓超凡（Chao-fan Deng）、陈晓梅（Xiao-mei Chen）以及中国药科大学（China Pharmaceutical University）的钟竹君（Zhu-jun Zhong）、辛贵忠（Gui-zhong Xin）和唐丹（Dan Tang）等研究人员共同完成。其中王雪、钟竹君和陈鹏飞为共同第一作者，辛贵忠和唐丹为共同通讯作者。该论文发表于《民族药理学杂志》（Journal of Ethnopharmacology）第340卷（2025年），文章编号119158，于2024年11月27日在线发表。
二、研究背景与目的
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病严重的微血管并发症，约占终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）病例的40%，全球不同类型糖尿病中DN发病率为23.4%–47.11%。目前临床常用的降糖药、降压药、降脂药及肾脏保护药物虽能在一定程度上延缓DN的发生发展，但存在不良反应且最终疗效不尽如人意，因此亟需寻找有效且不良反应小的替代疗法。大柴胡汤（DCHD）出自张仲景《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、白芍、枳实、大黄、半夏、生姜、大枣八味药组成，具有和解少阳、内泻热结之功效，在中国已有1800余年应用历史，临床上常用于治疗肥胖、胆囊炎、非酒精性脂肪肝、急性胰腺炎、高脂血症、高血压、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及代谢紊乱。临床观察提示DCHD可能对T2DM患者具有治疗益处，但其对DN的具体保护作用和机制尚不清楚，且DCHD中的主要活性成分和具体靶点亦有待明确。本研究旨在通过整合代谢组学和网络药理学，探讨DCHD能否预防T2DM小鼠肾损伤，并阐明其抗DN的机制。
三、研究流程与方法
该研究的工作流程主要包括五大部分，各部分依次递进、相互支撑。
第一部分：DCHD对T2DM小鼠肾损伤的药效学评价。 采用高脂饮食（high fat diet，HFD）喂养联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射建立T2DM小鼠模型。雄性C57BL/6J小鼠经7天适应性喂养后随机分组，对照组（con组，n=10）给予普通饲料，其余小鼠给予HFD。11周后HFD组小鼠以40 mg/kg STZ腹腔注射（两天一次，共7次），72小时后检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），若未达标准则补注STZ。FBG≥11.1 mmol/L者判定为糖尿病小鼠（n=40）。随后将糖尿病小鼠分为模型组（mod组）、DCHD低剂量组（DL组，6.3 g/kg/d灌胃）、DCHD高剂量组（DH组，12.6 g/kg/d灌胃）和利拉鲁肽组（LRG组，0.2 mg/kg/d静脉注射），con组和mod组给予等体积水，共给药10周。每2周测FBG，每1周测体重。第10周时进行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT），计算曲线下面积（area under curve，AUC）。实验结束前收集24小时尿液、血清及肾组织，检测FBG、血果糖胺（blood fructosamine，BFA）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿蛋白与尿肌酐比值（urine albumin-to-creatinine ratio，UACR）等生化指标，以ELISA测定胰岛素和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）水平，并进行肾脏HE、PAS、Masson染色及TGF-β1免疫组化分析。
第二部分：非靶向尿液代谢组学分析。 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对con、mod、DL、DH和LRG各组尿液样本进行正负离子模式采集。样品经冰乙腈沉淀蛋白、真空干燥、复溶、过滤后进样。色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1×150 mm），流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇，梯度洗脱。质谱扫描范围m/z 100–1250。通过MS-DIAL软件进行峰提取、归一化处理，SIMCA 14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以VIP>1且p<0.05为标准筛选差异代谢物，并通过HMDB和MS-DIAL数据库进行鉴定，利用MetaboAnalyst进行通路富集分析。
第三部分：DCHD化学成分及血浆吸收成分分析。 采用UPLC-HR MS/MS对DCHD水提物进行化学成分谱分析，共鉴定出260个代表性成分，包括132个黄酮类、17个三萜皂苷、23个单萜、11个苯丙素酸、27个蒽醌、12个鞣质和38个其他成分。进一步对DCHD给药后大鼠血浆进行分析，首次发现41个吸收入血成分，其中33个为黄酮类，提示黄酮类是DCHD体内主要暴露成分。
第四部分：网络药理学与“功能导向的基于网络的互补方法”（function-guided and network-based complementary methodology，FNICM）整合分析。 将代谢组学鉴定出的差异代谢物作为核心代谢物，利用FNICM方法扩展代谢网络以识别与DCHD疗效相关的核心代谢物，共获得33个核心代谢物。同时，对31个符合Lipinski五规则且无明显肝毒性的血浆吸收成分进行靶点预测，构建“药物-成分-靶点-通路”网络，进行GO和KEGG富集分析，预测DCHD干预DN的潜在通路。
第五部分：核心通路的实验验证。 通过ELISA检测血清和肾组织中AGEs水平，Western blotting检测肾组织中RAGE、AKT、p-AKT和GLO-1蛋白表达，以验证网络药理学预测的核心通路。
四、主要研究结果
药效学结果：DCHD治疗10周后，DL和DH组FBG较mod组显著下降（p<0.01，p<0.001），BFA、TG和TC水平以剂量依赖性方式降低，显示DCHD可调节糖脂代谢紊乱。OGTT结果显示DCHD组AUC较mod组显著降低（p<0.05），表明葡萄糖耐量得到改善。同时DCHD剂量依赖性地降低HOMA-IR和HOMA-ISI，提示其可改善胰岛素抵抗和胰岛素敏感性。肾功能方面，DCHD显著降低Scr和UACR水平，发挥肾脏保护作用。HE、PAS和Masson染色显示，DCHD可减小肾小球体积、减轻系膜扩张和糖原积累、改善肾间质纤维化；免疫组化显示DCHD显著降低TGF-β1表达，提示其可减轻肾纤维化。
代谢组学结果：在正负离子模式下，con组与mod组在PCA、PLS-DA和OPLS-DA中均呈现良好分离趋势，且DCHD治疗组有向con组回归的趋势，表明DCHD可部分逆转DN引起的代谢紊乱。共筛选出28个潜在生物标志物，主要涉及苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、酪氨酸代谢以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢等通路。其中硫酸对甲酚（p-cresol sulfate）和吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid）等蛋白结合型尿毒症毒素在mod组中上调，DCHD可调控这些代谢物水平。进一步整合FNICM，将核心代谢物扩展为33个，与本研究中发现的吸收成分及相关通路进行网络药理学分析。
网络药理学结果：31个血浆吸收成分预测得到271个成分靶点，与1538个DN疾病靶点取交集后获得151个共同靶点。PPI网络分析显示核心靶点包括TNF、AKT1、TP53、VEGFA、EGFR等。KEGG富集分析提示DCHD可能通过调节脂质代谢、动脉粥样硬化、癌症相关通路以及AGE/RAGE/AKT通路改善DN。GO分析亦表明DCHD的多靶点调控特性。
通路验证结果：mod组血清和肾组织中AGEs水平显著升高，DCHD处理可降低AGEs水平。Western blotting显示DCHD可下调RAGE蛋白表达、上调GLO-1蛋白表达，并恢复AKT磷酸化水平，证实DCHD可能通过抑制AGEs/RAGE/AKT通路发挥肾脏保护作用。
以上各部分结果形成了完整的证据链：药效学研究证实DCHD有效，代谢组学揭示代谢紊乱特征，化学成分分析明确体内暴露物质，网络药理学预测关键通路，最终通过分子生物学实验验证，共同支持“DCHD通过调控AGEs/RAGE/AKT通路防治DN”这一核心结论。
五、研究结论与价值
本研究首次系统鉴定了DCHD中260个化学成分，并首次在DCHD给药血浆中检测到41个生物可利用成分。动物实验证实DCHD可调节糖脂代谢紊乱、改善肾功能和肾脏病理损伤。通过整合非靶向尿液代谢组学、网络药理学、FNICM技术和实验药理学，首次从AGEs/RAGE/AKT通路角度系统阐明DCHD干预DN的机制。该研究为DCHD治疗DN提供了新的科学依据，也为中药复方防治糖尿病肾病的研究提供了方法学参考。
六、研究亮点
本研究的主要亮点包括：第一，首次对DCHD的化学组成和体内吸收成分进行了系统全面的分析，明确了黄酮类成分为其主要药效物质基础；第二，首次提出并应用FNICM这一功能导向的基于网络的互补方法，将检测型代谢组学与计算网络生物学相结合，有效识别与疗效相关的核心代谢物；第三，首次从AGEs/RAGE/AKT信号通路角度阐明DCHD防治DN的分子机制；第四，将代谢组学、网络药理学与实验药理学多层次整合，形成了从成分鉴定、药效评价、机制预测到实验验证的完整研究链条。