本研究由Yoshihiro Shimizu、Akio Inoue、Yukihide Tomari、Tsutomu Suzuki、Takashi Yokogawa、Kazuya Nishikawa和Takuya Ueda等人完成，其中第一作者和通讯作者Takuya Ueda隶属于东京大学前沿科学研究生院综合生物科学系，其他作者分别来自东京大学工学研究生院化学与生物技术系以及岐阜大学工学系生物分子科学专业。该研究于2001年8月发表在《Nature Biotechnology》第19卷上。
这项研究属于合成生物学与无细胞蛋白质合成领域。在分子生物学发展过程中，DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶等纯化酶的应用极大地推动了PCR扩增、体外RNA合成和cDNA生成等技术的发展，使研究者得以摆脱对活细胞的依赖。然而，翻译过程由于其高度复杂性，长期未能在体外实现高效重构。此前无细胞翻译主要依赖大肠杆菌、兔网织红细胞或小麦胚芽的粗细胞提取物，但这类系统存在能量电荷快速耗竭、蛋白酶和核酸酶降解产物或模板等问题。另一条路径是利用纯化组分重建翻译系统，但早期尝试因纯化方案复杂、缺少释放因子3和核糖体再循环因子，或氨酰tRNA合成酶体系不完整而导致蛋白产量较低。本研究的目标是利用重组带组氨酸标签的翻译因子，构建一个完全由纯化组分组成的、以天然mRNA为模板的高效无细胞翻译系统，并将其命名为“利用重组元件进行蛋白质合成”系统（PURE系统）。
在具体工作流程方面，作者首先从大肠杆菌基因组中PCR扩增了翻译起始因子IF1、IF2、IF3，延伸因子EF-G、EF-Tu、EF-Ts，释放因子RF1、RF3，核糖体再循环因子RRF，20种氨酰tRNA合成酶，甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶，T7 RNA聚合酶以及核苷二磷酸激酶等编码基因，并将它们克隆到带有组氨酸标签的融合表达载体中。这些蛋白质在大肠杆菌中过表达后，通过Ni²⁺亲和层析和咪唑梯度洗脱纯化至均一。SDS-PAGE电泳结果显示所有翻译因子和酶均达到均一纯化程度。此外，核糖体按照Spedding的方法从大肠杆菌A19细胞中通过蔗糖密度梯度离心纯化获得。PURE系统总共包含32种分别纯化的组分，包括IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts、RF1、RF3、RRF、20种氨酰tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶、T7 RNA聚合酶和核糖体，还含有46种tRNA、NTP、磷酸肌酸、10-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸、20种氨基酸、肌酸激酶、肌激酶、核苷二磷酸激酶和焦磷酸酶。
为了验证各纯化组分的活性，作者通过从PURE系统中逐一剔除某个组分并检测蛋白质合成下降程度来评估其必要性。结果显示大多数组分对翻译是不可或缺的，同时排除了其他大肠杆菌蛋白污染的可能性。IF1和甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶对蛋白质合成影响相对较小，这与先前报道的基因删除不致死以及无IF1时起始复合物仍可形成的结果一致。对于RF1、RF3和RRF的活性，作者采用了Pavlov等人建立的短合成mRNA方法，利用序列为AUGUUCUUGUAA的mRNA检测肽段释放。结果表明，RF1是肽段释放所必需的，RRF的加入显著增加了释放肽段量并实现了多轮翻译，而RF3的补充进一步提高了RF1和RRF介导的转换速率，证明这些纯化因子均具有活性。
在蛋白质合成实验中，PURE系统能够以T7 RNA聚合酶进行转录翻译偶联反应，成功合成了大肠杆菌二氢叶酸还原酶（DHFR）、λ溶菌酶、绿色荧光蛋白（GFP）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和噬菌体T7基因10产物等全长蛋白。除GST外，1毫升反应体积中每种蛋白的产量在1小时后均超过100微克。通过测定DHFR酶活性、λ溶菌酶裂解能力和GFP荧光，证实所合成的蛋白均为活性形式。其中合成的DHFR比活性为16.7±1.1 U/mg，与细胞中过表达并纯化的DHFR比活性16.0±0.80 U/mg相近。对DHFR合成时间进程的监测显示反应速率在1小时后下降，同时能量电荷从初始水平降至30%以下，表明反应终止的主要原因是化学能量耗竭。PURE系统的ATPase活性很低，未出现粗细胞提取物系统中与蛋白质合成无关的大量核苷三磷酸水解现象，因此该系统在能量转换方面非常高效。
在产物纯化方面，由于PURE系统中大多数组分带有组氨酸标签，作者设计了先通过截留分子量为100 kDa的超滤膜去除核糖体，再将滤过液通过Ni²⁺柱以去除带组氨酸标签组分的纯化流程。SDS-PAGE分析显示，经过该流程后获得了高度纯化的DHFR，且目标蛋白以无任何标签的天然形式表达和纯化，整个过程包括蛋白质合成反应在内可在数小时内完成。
在非天然氨基酸掺入方面，作者利用PURE系统的可操控性，通过省略释放因子RF1实现了琥珀密码子的有效抑制。实验模板为DHFR突变体，其中第37位天冬酰胺密码子被替换为UAG终止密码子，同时基因末端使用RF2特异性终止密码子UGA。在含有RF1的系统中，翻译产生在UAG处截短的蛋白；而省略RF1后，截短蛋白条带变得极弱。加入化学合成的携带缬氨酸的抑制型tRNA（Val-tRNA^sup）后，产生了全长蛋白，截短蛋白完全消失，表明抑制型tRNA对UAG密码子实现了高效通读。这一结果证明PURE系统可用于合成含非天然氨基酸的蛋白质。
本研究的核心结论是：利用纯化的重组翻译因子构建的PURE系统能够从模板核酸高效合成具有活性的天然蛋白质，产量在分批模式下达到约160 µg/ml/h。由于该系统仅含高度纯化组分，不含有核酸酶、蛋白酶以及水解核苷三磷酸的酶类，因此避免了许多粗提取物系统的固有缺陷。虽然该系统的绝对产量尚未超过Kim等人报道的400 µg/ml分批培养产量，但其能量转换效率高，且反应条件尚未完全优化，进一步研究有望提高生产率。此外，PURE系统不仅可用于天然蛋白质生产，还可作为一种工具用于合成具有新功能的非天然蛋白质。通过从反应混合物中省略特定因子即可实现对翻译过程的人工控制，这种策略在粗细胞提取物系统中无法实现。例如，省略RF1即可将终止密码子完全转变为有义密码子，避免抑制型tRNA与终止因子的竞争问题。类似方法也可用于替换特定氨酰tRNA合成酶，从而构建基于非经典遗传密码的翻译系统。
本研究的主要亮点在于：首次利用完全纯化的重组组分成功构建了高效、可操控的无细胞翻译系统；通过组氨酸标签策略实现了翻译因子的一步亲和纯化和产物的快速分离；展示了通过简单省略释放因子实现非天然氨基酸高效掺入的新策略。该系统的建立为无细胞合成生物学、非天然蛋白质工程以及人工遗传密码重构提供了重要平台。此外，研究还指出PURE系统缺少RNA解旋酶，可能对mRNA二级结构更敏感，这为后续系统优化指明了方向。