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单分子棘轮运动：基于Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)纳米孔的肽段测序研究

1. 研究团队与发表信息

本研究由Shuanghong Yan、Jinyue Zhang等共同完成，通讯作者为Shuo Huang（南京大学化学化工学院、生命分析化学国家重点实验室）。研究成果发表于《Nano Letters》（2021年7月28日，卷21，页6703–6710），标题为《Single Molecule Ratcheting Motion of Peptides in a Mycobacterium smegmatis Porin A (MspA) Nanopore》。

2. 学术背景

科学领域：本研究属于纳米孔单分子检测技术与蛋白质测序的交叉领域。
研究动机：蛋白质的氨基酸序列决定了其功能，但现有测序技术（如Edman降解、质谱法）存在检测限高、无法扩增单分子等局限性。受DNA/RNA纳米孔测序成功的启发，研究者尝试开发类似的肽链测序技术，但核心挑战在于如何实现肽链的可控棘轮运动（ratcheting motion）。
目标：通过构建肽-寡核苷酸缀合物（POC, peptide-oligonucleotide conjugate），结合纳米孔诱导相移测序（NIPSS, nanopore-induced phase-shift sequencing），首次实现肽链在纳米孔中的单分子棘轮运动观测，并验证其序列依赖性信号模式。

3. 研究流程与方法

3.1 POC构建与设计

• 研究对象：设计多种POC（如POC-N1、POC-N2、POC-N3、POC-C1等），其肽段长度、氨基酸序列（如连续天冬氨酸或色氨酸替换）及连接位点（N端或C端）不同。
  
• 关键技术：
  
  • 化学缀合：通过接头（如abasic spacer标记）将肽段与寡核苷酸共价连接。
    
  • 标记设计：引入abasic spacer（X）作为信号标记，区分寡核苷酸与肽段区域。
    

3.2 纳米孔实验体系

• 纳米孔选择：使用MspA纳米孔（孔径约1.2 nm），搭配Phi29 DNA聚合酶（Phi29 DNAP）驱动POC的棘轮运动。
  
• 实验条件：缓冲液（0.3 M KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5），施加+180 mV电压，记录电流信号（开放孔电流~125 pA）。
  
• NIPSS流程：
  
  1. 捕获与解链：POC复合物被纳米孔捕获，电场力解离阻断链（blocker strand）。
     
  2. 酶促棘轮运动：Phi29 DNAP启动引物延伸，推动POC逐步通过纳米孔狭窄区，产生阶梯式电流信号。
     

3.3 数据采集与分析

• 信号解析：电流信号分为三部分：
  
  • 寡核苷酸段（黑色信号）：重复序列TTTCAAGA生成三角形模式。
    
  • Abasic spacer（红色信号）：高电流特征峰。
    
  • 肽段（蓝色信号）：序列依赖性阶梯信号。
    
• 统计验证：通过21次重复事件分析，量化步骤电流均值与标准差（图S7）。
  

4. 主要结果

4.1 肽段棘轮运动的直接观测

• POC-N1实验：首次观察到肽段（6–7个氨基酸）的离散棘轮步骤（图1c），信号模式高度一致（图S6）。
  
• 对照实验：用DNA模板（dna1）替代肽段时，信号模式仅在abasic spacer后出现差异（图S8），证实肽段特异性。
  

4.2 单氨基酸替换的检测

• POC-N2 vs POC-N3：
  
  • POC-N2含13个连续天冬氨酸（D），电流信号平坦（图2e）。
    
  • POC-N3中单个色氨酸（W）替换导致电流下降5.18 pA（图2f），且步骤V和VI仅出现在POC-N3中（图S10）。
    
• 统计显著性：20次事件分析显示，色氨酸引入显著改变电流差（ΔI）和波动性（图2g-h）。
  

4.3 C端肽段的测序可行性

• POC-C1设计：通过EMCS接头将寡核苷酸缀合至肽段C端（图3a）。
  
• 结果：信号模式与N端POC不同（图3b），证明NIPSS可兼容C端测序。
  

4.4 不同肽段的区分能力

• POC-C1 vs POC-C2：仅6个氨基酸差异即可通过电流步骤（4–8步）显著区分（图4d-e）。
  

5. 结论与意义

• 科学价值：
  
  1. 首次实现肽链纳米孔棘轮运动，为单分子蛋白质测序奠定基础。
     
  2. 验证NIPSS策略可检测单氨基酸变异，分辨率达5–6个氨基酸。
     
  3. 兼容N端/C端肽段，扩展了应用场景。
     
• 应用潜力：未来或可用于蛋白质指纹图谱、疾病标志物检测。
  

6. 研究亮点

1. 方法创新：
   
   • 开发POC构建策略，结合NIPSS实现肽链可控运动。
     
   • 利用Phi29 DNAP增强时间分辨率，克服直接易位过快的问题。
     
2. 技术突破：首次在纳米孔中观测到肽链的序列依赖性信号。
   
3. 局限性：
   
   • 读长受限（约14个核苷酸等效长度）。
     
   • 需化学修饰肽段（如末端半胱氨酸）。
     

7. 其他价值

• 未来方向：
  
  • 设计DNA-肽段-DNA三明治结构以提高信噪比。
    
  • 通过金属功能化MspA或分子动力学模拟优化氨基酸识别。
    
  • 结合人工智能解析复杂信号模式。
    

本研究为蛋白质纳米孔测序提供了概念验证，尽管离实际应用仍有距离，但其方法论创新为后续研究开辟了新路径。