这项研究的主要作者是Kevin Kyungsuk Park， Kai Liu， Yang Hu， Patrice D. Smith， Chen Wang， Bin Cai， Bengang Xu， Lauren Connolly， Ioannis Kramvis， Mustafa Sahin以及通讯作者Zhigang He。他们来自F. M. Kirby Neurobiology Center, Children‘s Hospital, and Department of Neurology, Harvard Medical School。这项研究成果发表于2008年11月7日的《Science》期刊上，文章标题为”Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway”。

本研究属于神经再生领域，具体聚焦于中枢神经系统损伤后的轴突再生修复。在成年哺乳动物的中枢神经系统中，轴突在损伤后无法再生，这构成了神经功能恢复的主要障碍。传统观点将此归因于两个因素：一是抑制性的细胞外环境（如存在髓鞘相关抑制剂和硫酸软骨素蛋白聚糖等），二是成熟神经元内在再生能力的下降。尽管针对细胞外抑制分子的中和策略取得了一定进展，但所能诱导的轴突再生程度非常有限。因此，研究者们开始关注控制神经元内在再生能力的机制。本研究的学术背景基于一个观察：许多控制细胞生长和大小的进化保守信号通路，虽然在发育完成后被用来防止细胞过度生长，但它们也持续表达于成熟的有丝分裂后神经元中。研究团队由此提出假设：这些内在的生长控制通路可能限制了成年中枢神经系统神经元的再生能力。本研究的主要目的是系统性地探究特定的细胞生长控制基因在成年神经元轴突再生中的作用，并确定是否有某种内在机制的调控足以在成年中枢神经系统损伤后，克服抑制性环境，实现显著的轴突再生。

本研究采用了一套严谨而创新的实验流程，主要分为几个核心步骤。首先，为了克服传统基因敲除小鼠胚胎致死或发育异常的问题，研究团队设计了一种病毒辅助的活体条件性基因敲除策略。他们向成年小鼠的玻璃体腔内注射表达Cre重组酶的腺相关病毒（AAV-Cre）。这种方法在两种报告基因品系小鼠中得到了验证，结果显示，AAV-Cre能够高效且特异性地感染超过90%的视网膜神经节细胞，而很少感染其他非RGC细胞，从而实现了在成年动物中对特定基因在RGC中进行条件性敲除。第二步，研究团队利用这一技术，系统性地筛选了多个与细胞生长调控相关的基因。他们将AAV-Cre注射到多种携带“floxed”条件性等位基因的成年小鼠品系的玻璃体中，这些品系包括Rbf/f, p53f/f, Smad4f/f, Dicerf/f, Lkb1/f以及Ptenf/f小鼠。在病毒注射两周后（此时基因敲除效应已建立），对这些动物进行视神经挤压损伤手术。第三步，对轴突再生和神经元存活进行评估。轴突再生的检测是通过在损伤前或损伤后向眼睛注射顺行示踪剂霍乱毒素B亚单位，然后在损伤部位不同距离的视神经横截面上观察和计数被标记的轴突纤维。神经元存活则通过视网膜全铺片免疫染色（使用β-III微管蛋白抗体Tuj1）或在损伤前通过向上丘注射Fluorogold预先标记RGC来估算。研究采用了定量的方法，对再生纤维的数量、延伸距离以及存活RGC的比例进行了统计分析。第四步，在发现PTEN缺失效果最显著后，研究团队深入探究了其作用的分子机制和时间进程。他们通过免疫组织化学方法，使用磷酸化S6核糖体蛋白的抗体来监测mTOR通路的活性。同时，还评估了轴突损伤对RGC内新生蛋白质合成速率的影响，方法是从对照组和损伤组大鼠中分离纯化RGC，并在体外用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸进行脉冲标记，测量蛋白质合成速率。第五步，为了验证mTOR通路激活的必要性，他们在PTEN条件性敲除小鼠中使用了mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素，观察其对神经元存活和轴突再生的影响。第六步，为了进一步验证激活mTOR通路是否足以促进再生，他们对另一个mTOR通路的负调控因子——结节性硬化症复合物1进行了条件性敲除实验，使用Tsc1f/f小鼠重复了上述视神经损伤和再生评估流程。在整个研究过程中，还运用了电子显微镜来观察损伤部位的超微结构变化，以及使用生物素化葡聚糖胺进行逆行追踪，以确认再生轴突的细胞来源。数据分析主要涉及组间比较的统计学检验，如方差分析、Bonferroni事后检验、Student’s t检验等，所有定量数据均以平均值±标准误表示，并标明星号表示显著性差异。

本研究取得了多项关键结果。在第一阶段的基因筛选中，PTEN的缺失显示出最显著的效果。在注射了AAV-Cre的Ptenf/f条件性突变小鼠中，损伤后RGC的存活率显著提高（约45%，对照组约20%）。更重要的是，在存活的RGC中，约有8-10%的细胞其受损轴突能再生超过损伤中心远端0.5毫米，有些甚至延伸超过3毫米。这些再生纤维随时间持续生长，在损伤后4周，部分纤维可延伸至视交叉区域。相比之下，其他测试的基因中，仅p53缺失能提高神经元存活，但不能促进轴突再生，这证实了促进存活本身不足以驱动轴突再生。在机制探索方面，研究发现mTOR通路活性随发育下降：在大多数胚胎神经元中可检测到强的磷酸化S6信号，但在90%的成年RGC中该信号减弱，提示mTOR信号在成年神经元中被下调。轴突损伤会进一步抑制该通路：在野生型小鼠中，视神经挤压损伤几乎完全废除了成年RGC中残存的p-S6信号，且这种抑制在损伤后1、3、7天持续存在。与此一致，新生蛋白质合成实验显示，轴突损伤后的RGC其新生蛋白质合成速率显著降低。然而，在PTEN缺失的RGC中，尽管遭受轴突切断的应激，这些神经元仍能维持与未损伤野生型神经元相似的mTOR活性水平（p-S6阳性）。值得注意的是，再生纤维的比例（8-10%）与p-S6阳性的轴突损伤后RGC比例相似。通过逆行追踪实验进一步证实，在PTEN缺失动物中，那些被远端注射示踪剂标记的、成功再生轴突的RGC，其中88%是p-S6阳性的，表明大多数再生纤维来源于那些mTOR通路活跃的神经元。必要性验证实验表明，使用雷帕霉素抑制mTOR活性，能显著降低PTEN缺失RGC中的p-S6信号，并基本抵消了PTEN缺失所带来的神经元存活和轴突再生的促进作用，这证明mTOR通路的激活是PTEN缺失产生效果的主要媒介。充分性验证实验显示，条件性敲除另一个mTOR负调控因子TSC1，同样能在损伤后导致RGC中强烈的p-S6信号、增强的神经元存活以及显著的轴突再生，尽管再生程度略弱于PTEN缺失。这些结果逻辑连贯：从筛选发现PTEN缺失的有效性，到揭示其通过激活mTOR通路起作用，再到证明mTOR活性在损伤后受到抑制且与蛋白质合成能力下降相关，最后通过功能获得（敲除TSC1）和功能丧失（使用雷帕霉素）实验证实了mTOR通路在调控轴突再生中的核心作用和充分必要性。

本研究得出的核心结论是，调节mTOR通路和蛋白质翻译在决定受损中枢神经系统神经元内在的轴突再生长反应性中起着关键作用。该通路在轴突损伤后的成年神经元中被深度抑制，这可能限制了持续轴突再生所需的新蛋白质合成。通过在成年神经元中沉默PTEN或TSC1来重新激活mTOR通路，足以诱导广泛的轴突再生。这表明，在轴突损伤后的成熟神经元中保持活跃的蛋白质合成，就足以启动轴突再生的神经元再生程序。这一发现不仅揭示了成年CNS神经元再生失败的一个重要内在机制，还为治疗干预提供了新的靶点。

本研究的亮点突出。首先，在科学发现上，它首次明确揭示了mTOR信号通路在成年中枢神经系统轴突再生中的核心调控作用，将细胞生长控制机制与神经再生能力直接联系起来。其次，在研究方法上，创新性地采用了病毒介导的活体条件性基因敲除策略，克服了传统基因敲除的发育限制，实现了在成年动物特定神经元类型中对目标基因的功能研究，这是一项重要的技术突破。第三，研究逻辑非常严谨，从系统性筛选到机制深挖，再到必要性和充分性验证，构成了一个完整的证据链，结论可信度高。第四，研究不仅关注轴突再生的形态学结果，还深入探究了其背后的细胞生物学机制（蛋白质合成），并将再生表型与特定的分子信号状态（p-S6阳性）关联起来。

此外，研究还具有重要的潜在应用价值。作者在文中特别指出，鉴于已有针对PTEN的特异性化学抑制剂正在开发，本文所揭示的策略（即调控PTEN/mTOR通路）有可能在未来转化为临床治疗方案，通过在CNS损伤后短暂应用相关药物，来阻止蛋白质合成的下调，从而促进轴突再生和功能恢复。这为脊髓损伤、视神经损伤等中枢神经创伤的治疗带来了新的希望和方向。